Identification and activation of novel biosynthetic gene clusters by genome mining in the kirromycin producer Streptomyces collinus Tü 365
- 作者
- Dumitrita Iftime, Andreas Kulik, Thomas Härtner, Sabrina Rohrer, Timo Horst Johannes Niedermeyer, Evi Stegmann, Tilmann Weber, Wolfgang Wohlleben
- 单位
- Lehrstuhl für Mikrobiologie/Biotechnologie, Interfakultäres Institut für Mikrobiologie und Infektionsmedizin Tübingen, Eberhard Karls Universität Tübingen; German Centre for Infection Research (DZIF), Partner Site Tübingen; The Novo Nordisk Foundation Center for Biosustainability, Technical University of Denmark
- 杂志
- Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology（2015）
- DOI
- 10.1007/s10295-015-1685-7
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
系统挖掘并激活kirromycin产生菌Streptomyces collinus Tü 365中尚未表征的次级代谢生物合成基因簇，鉴定其对应产物。
研究策略
利用antiSMASH等生物信息学工具对S. collinus Tü 365进行全基因组挖掘，预测32个次级代谢基因簇；通过优化培养条件（如H2O2氧化应激）和异源表达（如将crt基因簇转入Amycolatopsis japonica）激活沉默基因簇，结合HPLC-MS、GC-MS等方法鉴定产物。
核心内容
该研究对kirromycin产生菌Streptomyces collinus Tü 365进行了系统的基因组挖掘，旨在激活并鉴定其中未表征的次级代谢生物合成基因簇及其产物。研究者利用antiSMASH等工具对该菌株全基因组进行分析，预测出32个次级代谢基因簇，约占基因组的14%。随后通过优化培养条件（如100 μM H2O2氧化应激）和异源表达等策略激活沉默基因簇，并结合HPLC-MS、GC-MS等方法鉴定产物。结果显示，该菌株基因组大小为8.37 Mb，G+C含量72.6%，多个基因簇位于630 kb的末端反向重复区域而存在双拷贝。氧化应激处理后在原菌中检测到类胡萝卜素isorenieratene（m/z 528.5）；将含crt基因簇的25 kb cosmid转入Amycolatopsis japonica后成功产生lycopene、β-carotene等；此外还检测到pentalenene（m/z 204）、hopene（m/z 410）、desferrioxamine E（[M+H]+=601.5）等多种产物。该工作揭示了S. collinus Tü 365蕴含丰富的次级代谢潜力，证明基因组挖掘结合培养优化与异源表达是激活隐蔽基因簇的有效策略，为发现新天然产物提供了可行途径。
创新点
首次对S. collinus Tü 365进行系统的全基因组次级代谢基因簇分析；发现多个基因簇位于染色体末端反向重复（双拷贝）；通过氧化应激和异源表达成功激活并鉴定了类胡萝卜素、铁载体、萜类等多种沉默基因簇产物。
研究对象（40）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Streptomyces collinus Tü 365 | Kirromycin生物合成 | kirT | KirT (ABC转运蛋白) | 转运 | 推测参与kirromycin抗性，基因中断突变株产量与野生型相当 |
| Streptomyces collinus Tü 365 | Kirromycin生物合成 | kirD | KirD (天冬氨酸α-脱羧酶) | 催化 | 参与前体β-丙氨酸的生物合成 |
| Streptomyces collinus Tü 365 | Kirromycin生物合成 | kirP | KirP (磷酸泛酰巯基乙胺转移酶) | 催化 | 激活NRPS/PKS的ACP和PCP结构域 |
| Streptomyces collinus Tü 365 | Kirromycin生物合成 | kirCII | KirCII (酰基转移酶) | 催化 | 将乙基丙二酰-CoA装载到特定ACP上 |
| Streptomyces collinus Tü 365 | Lanthipeptide (streptocollin) 生物合成 | stcL | StcL (羊毛硫肽合成酶) | 催化 | IV类羊毛硫肽合成酶 |
| Streptomyces collinus Tü 365 | Lanthipeptide (streptocollin) 生物合成 | stcT | StcT (ABC转运蛋白ATP结合亚基) | 转运 | 双组分ABC转运蛋白的ATP结合元件 |
| Streptomyces collinus Tü 365 | Lanthipeptide (streptocollin) 生物合成 | stcH | StcH (ABC转运蛋白通透酶亚基) | 转运 | 双组分ABC转运蛋白的膜通透酶亚基 |
| Streptomyces collinus Tü 365 (基因来源) / Amycolatopsis japonica (异源表达宿主) | Isorenieratene生物合成 | crtE | CrtE (牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶) | 催化 | 异源表达于A. japonica后产生类胡萝卜素 |
| Streptomyces collinus Tü 365 (基因来源) / Amycolatopsis japonica (异源表达宿主) | Isorenieratene生物合成 | crtB | CrtB (八氢番茄红素合酶) | 催化 | 催化两分子GGPP生成八氢番茄红素 |
| Streptomyces collinus Tü 365 (基因来源) / Amycolatopsis japonica (异源表达宿主) | Isorenieratene生物合成 | crtI | CrtI (八氢番茄红素脱氢酶) | 催化 | 将八氢番茄红素转化为番茄红素 |
| Streptomyces collinus Tü 365 (基因来源) / Amycolatopsis japonica (异源表达宿主) | Isorenieratene生物合成 | crtY | CrtY (番茄红素环化酶) | 催化 | 催化番茄红素环化生成β-胡萝卜素 |
| Streptomyces collinus Tü 365 (基因来源) / Amycolatopsis japonica (异源表达宿主) | Isorenieratene生物合成 | crtU | CrtU (β-胡萝卜素脱氢酶) | 催化 | 将β-胡萝卜素转化为isorenieratene |
| Streptomyces collinus Tü 365 | Pentalenolactone生物合成 | B446_29695 (ptlA) | PtlA (pentalenene合酶) | 催化 | 催化FPP环化生成pentalenene |
| Streptomyces collinus Tü 365 | Pentalenolactone生物合成 | B446_29655 (ptlR) | PtlR (MarR家族转录调控因子) | 调控 | 调控pentalenolactone生物合成 |
| Streptomyces collinus Tü 365 | Pentalenolactone生物合成 | B446_29670 (ptlG) | PtlG (MFS转运蛋白) | 转运 | 跨膜外排蛋白 |
| Streptomyces collinus Tü 365 | Hopanoid生物合成 | B446_30850 | Squalene-hopene环化酶 | 催化 | 催化鲨烯环化生成hopene |
| Streptomyces collinus Tü 365 | Hopanoid生物合成 | B446_30845 | 聚异戊二烯二磷酸合酶 | 催化 | 可能参与FPP合成 |
| Streptomyces collinus Tü 365 | Hopanoid生物合成 | B446_30860 | Radical SAM酶 | 催化 | 推测催化hopene的腺苷化修饰 |
| Streptomyces collinus Tü 365 | Albaflavenone生物合成 | B446_24610 | 萜烯环化酶 | 催化 | 催化FPP环化生成epi-isozizaene |
| Streptomyces collinus Tü 365 | Albaflavenone生物合成 | B446_24615 | 细胞色素P450单加氧酶 | 催化 | 两步氧化epi-isozizaene生成albaflavenone |
| Streptomyces collinus Tü 365 | Geosmin生物合成 | B446_28510 | Geosmin合酶 | 催化 | 催化FPP转化为geosmin |
| Streptomyces collinus Tü 365 | 2-甲基异冰片 (2-MIB) 生物合成 | B446_04425 | 2-MIB合酶 | 催化 | 催化甲基牻牛儿基二磷酸环化生成2-MIB |
| Streptomyces collinus Tü 365 | 2-甲基异冰片 (2-MIB) 生物合成 | B446_04430 | 甲基转移酶 | 催化 | 将牻牛儿基二磷酸甲基化 |
| Streptomyces collinus Tü 365 | Desferrioxamine E生物合成 | B446_14675 (desA) | DesA (吡哆醛依赖脱羧酶) | 催化 | 将L-赖氨酸脱羧生成尸胺 |
| Streptomyces collinus Tü 365 | Desferrioxamine E生物合成 | B446_14680 (desB) | DesB (单加氧酶) | 催化 | 氧化尸胺生成N-羟基尸胺 |
| Streptomyces collinus Tü 365 | Desferrioxamine E生物合成 | B446_14685 (desC) | DesC (乙酰转移酶) | 催化 | 添加琥珀酰基生成N-羟基-N-琥珀酰尸胺 |
| Streptomyces collinus Tü 365 | Desferrioxamine E生物合成 | B446_14690 (desD) | DesD (NTP依赖性连接酶) | 催化 | 将3分子N-羟基-N-琥珀酰尸胺缩合为desferrioxamine E |
| Streptomyces collinus Tü 365 | 孢子色素生物合成 | B446_17640 | β-酮酰基合酶α亚基 (KSα) | 催化 | II型PKS的最小PKS组分 |
| Streptomyces collinus Tü 365 | 孢子色素生物合成 | B446_17635 | β-酮酰基合酶β亚基/链长因子 (KSβ/CLF) | 催化 | II型PKS的链长因子 |
| Streptomyces collinus Tü 365 | 孢子色素生物合成 | B446_17630 | 酰基载体蛋白 (ACP) | 催化 | 聚酮合成中承担酰基载体功能 |
| Streptomyces collinus Tü 365 | 孢子色素生物合成 | B446_17645 | 环化酶 | 催化 | 催化新生聚酮链环化 |
| Streptomyces collinus Tü 365 | 孢子色素生物合成 | B446_17625 | 芳香化酶 | 催化 | 催化环化后的芳香化 |
| Streptomyces collinus Tü 365 | 孢子色素生物合成 | B446_17655 | 聚酮羟化酶 | 催化 | 向环化聚酮引入羟基 |
| Streptomyces collinus Tü 365 | Ectoine生物合成 | B446_09700 (ectA) | EctA (酰基转移酶) | 催化 | 向L-二氨基丁酸添加乙酰基 |
| Streptomyces collinus Tü 365 | Ectoine生物合成 | B446_09705 (ectB) | EctB (二氨基丁酸氨基转移酶) | 催化 | 将L-天冬氨酸-β-半醛转化为L-二氨基丁酸 |
| Streptomyces collinus Tü 365 | Ectoine生物合成 | B446_09710 (ectC) | EctC (ectoine合酶) | 催化 | 催化生成ectoine |
| Streptomyces collinus Tü 365 | Ectoine生物合成 | B446_09715 (ectD) | EctD (ectoine羟化酶) | 催化 | 将ectoine转化为hydroxyectoine |
| Streptomyces collinus Tü 365 | 甲萘醌 (menaquinone) 生物合成 | B446_21435 (mqnA) | MqnA (分支酸脱水酶) | 催化 | 催化分支酸转化为3-((1-羧基乙烯基)氧基)苯甲酸 |
| Streptomyces collinus Tü 365 | 甲萘醌 (menaquinone) 生物合成 | B446_17345 (mqnB) | MqnB (氨基脱氧辅酶A脱氨酶) | 催化 | 参与aminofutalosine途径 |
| Streptomyces collinus Tü 365 | 甲萘醌 (menaquinone) 生物合成 | B446_21370 (mqnE) | MqnE (Radical SAM酶) | 催化 | 参与甲萘醌生物合成 |
关键发现
- S. collinus Tü 365基因组大小为8.37 Mb，G+C含量72.6%，编码7193个蛋白质，长末端反向重复区长度为630 kb；antiSMASH预测共32个次级代谢基因簇，约占基因组14%，其中3个基因簇（lanthipeptide、atypical NRPS、kirromycin）位于末端反向重复，存在双拷贝；经100 μM H2O2氧化应激处理后，在S. collinus Tü 365中检测到类胡萝卜素isorenieratene（APCI-MS，m/z
- 5）；将含crt基因簇的25 kb cosmid异源表达于Amycolatopsis japonica，培养5天后产生lycopene、β-carotene和isorenieratene；GC-MS检测到pentalenene（m/z 204）和hopene（m/z 410），验证了pentalenolactone和hopanoid生物合成途径；HPLC-ESI-MS检测到kirromycin（[M-H]- =
- 5 m/z）、desferrioxamine E（[M+H]+ =
- 5 m/z）和deoxydehydrochorismic acid（[M-H]- =
- 16 m/z）；多个基因簇与已知簇同源性高（如ptl基因与S. avermitilis对应基因一致性达69-88%）。
研究结论
S. collinus Tü 365蕴含丰富的次级代谢潜力，基因组挖掘结合培养优化和异源表达成功鉴定了多个先前未描述的新产物（lanthipeptide、类胡萝卜素、pentalenolactone、hopene、desferrioxamine E等），并推测了更多基因簇的产物，为激活和利用隐蔽基因簇提供了有效策略。