Characterization and site-directed mutation of a novel aldo-keto reductase from Loddermyces elongisporus NRRL YB-4239 with high production rate of ethyl (R)-4-chloro-3-hydroxybutanoate
- 作者
- Qiuyan Wang, Tingting Ye, Zhuanzhuan Ma, Rong Chen, Tian Xie, Xiaopu Yin
- 单位
- College of Material, Chemistry and Chemical Engineering, Hangzhou Normal University; College of Life and Environmental Sciences, Hangzhou Normal University; Medical College, Hangzhou Normal University
- 杂志
- Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology（2014）
- DOI
- 10.1007/s10295-014-1502-8
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
缺乏高效、高对映选择性的(R)-特异性羰基还原酶用于生产手性药物中间体(R)-CHBE，现有酶产量或对映选择性不足，且催化过程耗时、难以工业化。
研究策略
通过基因组数据库挖掘从Loddermyces elongisporus中发现新型醛酮还原酶LEK，结合序列比对、保守催化基序分析和3D分子模型模拟进行筛选；对关键氨基酸进行定点突变改善催化性能；构建基于葡萄糖脱氢酶（GDH）的辅酶再生系统实现高效生物转化。
核心内容
本研究从Loddermyces elongisporus NRRL YB-4239基因组中发掘出一种新型醛酮还原酶LEK，该酶以NADPH为辅因子，催化4-氯乙酰乙酸乙酯（COBE）不对称还原生成手性药物中间体(R)-CHBE。通过序列比对和3D分子模型分析，对关键氨基酸进行定点突变，获得两个催化性能显著改善的突变体S209G和W28A。动力学分析显示，突变体S209G的Km值由野生型的37.01 mM降至6.05 mM，摩尔转化率从78.0%提升至99.0%。进一步构建基于葡萄糖脱氢酶的辅酶再生系统，将分别携带LEK S209G和GDH的E. coli细胞共培养，在51.8 mM COBE底物条件下实现100%转化率，对映选择性大于99%，产率高达56.51 mmol/L/H，为当时报道的(R)-CHBE不对称生物转化最高水平。此外，研究发现Mn²⁺可将LEK活性提升至181.8%，而Fe³⁺和Cu²⁺完全抑制酶活。该研究提供了一种高效制备光学纯(R)-CHBE的生物催化路线，定点突变策略也为其他醛酮还原酶的改造提供了参考。
创新点
['从Loddermyces elongisporus NRRL YB-4239中发掘出新型醛酮还原酶LEK', '通过定点突变获得两个催化性能显著改善的突变体W28A和S209G', '构建双质粒共表达辅酶再生系统，使(R)-CHBE的产率达到目前报道的最高水平']
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21 (DE3) | 不对称还原合成(R)-CHBE | LEK (LELG_05392) | 醛酮还原酶 LEK | 催化 | 来源于Loddermyces elongisporus NRRL YB-4239，催化COBE不对称还原为(R)-CHBE，e.e.>99% |
| Escherichia coli BL21 (DE3) | 不对称还原合成(R)-CHBE | LEK (S209G突变体) | 醛酮还原酶 LEK S209G | 催化 | 定点突变体，摩尔转化率99.0%，Km=6.05 mM，e.e.>99% |
| Escherichia coli BL21 (DE3) | 不对称还原合成(R)-CHBE | LEK (W28A突变体) | 醛酮还原酶 LEK W28A | 催化 | 定点突变体，摩尔转化率87.9%，Km=14.08 mM，e.e.>99% |
| Escherichia coli BL21 (DE3) | 辅酶再生 | gdh | 葡萄糖脱氢酶 GDH | 能量供给 | 来自Bacillus subtilis，催化葡萄糖氧化再生NADPH，为LEK提供还原力 |
关键发现
['LEK以NADPH为辅因子，对COBE的酶活为0.178 U/mg，相对活性90.7%，Km值为37.01 mM，Kcat为9.96 μmol/min，Kcat/Km为0.27 μmol/mM/min', '突变体S209G和W28A的摩尔转化率分别为99.0%和87.9%，均高于野生型LEK的78.0%，Km值分别为6.05 mM和14.08 mM，显著低于野生型37.01 mM', '使用分别携带pETLEKS209G和pETGDH的E. coli细胞构建辅酶再生系统，在51.8 mM COBE条件下转化率达100%，e.e.>99%，产率高达56.51 mmol/L/H，为已报道的(R)-CHBE不对称生物转化最高产率', '使用共表达质粒pETDuet-LEKS209G-GDH时，12.3 mM COBE转化率100%，22.2 mM COBE转化率95%，但产率仅6.03 mmol/L/H，因双质粒共表达水平低(约10%)', 'Mn2+、Li+、Ca2+分别提高LEK活性至181.8%、125.4%、121.8%，Fe3+和Cu2+完全抑制酶活性']
研究结论
LEK是一种新型的(R)-选择性醛酮还原酶，通过定点突变S209G和W28A显著提高了底物亲和力和转化率。利用E. coli分别表达LEKS209G和GDH构建的辅酶再生系统能够高效合成光学纯(R)-CHBE，产率高达56.51 mmol/L/H，对映选择性>99%，具有工业应用潜力。