Breeding of a xylose-fermenting hybrid strain by mating genetically engineered haploid strains derived from industrial Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- Hiroyuki Inoue, Seitaro Hashimoto, Akinori Matsushika, Seiya Watanabe, Shigeki Sawayama
- 单位
- Biomass Refinery Research Center (BRRC), National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST); Division of Applied Biosciences, Graduate School of Agriculture, Kyoto University; Faculty of Agriculture, Ehime University
- 杂志
- Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology（2014）
- DOI
- 10.1007/s10295-014-1531-3
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
利用工业酿酒酵母IR-2的单倍体菌株，通过交配育种构建能高效发酵木糖的二倍体菌株，并评估野生型XDH与工程化NADP+依赖型XDH（ARSdR）对木糖发酵的影响。
研究策略
从工业菌株IR-2分离单倍体，筛选木酮糖发酵速率高的单倍体；将木糖同化基因（XYL1、XYL2或ARSdR、XKS1）整合到单倍体中；通过交配获得杂合二倍体，筛选并进行木糖和木酮糖发酵性能评价。
核心内容
该研究从工业酿酒酵母IR-2中分离出单倍体菌株ENB2004和ENB3002，其木酮糖消耗速率分别为0.50和0.81 g/L/h。将木糖同化基因（XYL1、XYL2或ARSdR、XKS1）整合到单倍体后通过交配构建杂合二倍体，获得菌株SE12等。在YPX培养基（21 g/L木糖）中，SE12和MA-R5在72小时分别产生5.80和5.65 g/L乙醇，木糖醇分泌仅占消耗木糖的4.7%和6.7%，而携带野生型XDH的MA-R4木糖醇分泌高达33%；在含45 g/L葡萄糖和45 g/L木糖的YPDX培养基中，SE12和MA-R5完全消耗木糖，MA-R4残留13 g/L木糖。多数杂交菌株中工程化NADP+依赖型XDH（ARSdR）活性高于野生型XDH，表明ARSdR更有利于木糖同化与乙醇生产。该研究证明工业菌株来源的单倍体交配育种策略可行，且杂合菌株SE12与单基因整合菌株MA-R5发酵性能相当，保留了IR-2的优良遗传背景，为木糖发酵酵母的工业育种提供了新途径。
创新点
首次利用工业酿酒酵母IR-2来源的单倍体进行交配育种构建木糖发酵菌株；比较了不同辅酶特异性的木糖醇脱氢酶在杂交菌株中的活性与发酵效果，证明ARSdR具有优越性。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae IR-2 | 木糖同化途径 | XYL1 | 木糖还原酶（XR） | 催化 | NADPH依赖，催化木糖还原为木糖醇 |
| Saccharomyces cerevisiae IR-2 | 木糖同化途径 | XYL2 | 木糖醇脱氢酶（XDH） | 催化 | 野生型NAD+依赖，催化木糖醇氧化为木酮糖 |
| Saccharomyces cerevisiae IR-2 | 木糖同化途径 | ARSdR | 工程化NADP+依赖型木糖醇脱氢酶 | 催化 | 由XYL2改造，对NADP+的kcat/Km比野生型高>4500倍 |
| Saccharomyces cerevisiae IR-2 | 木糖同化途径 | XKS1 | 木酮糖激酶（XK） | 催化 | 催化木酮糖磷酸化为5-磷酸木酮糖 |
| Saccharomyces cerevisiae IR-2 单倍体（ENB2004/ENB3002） | 木糖同化途径 | 多基因（XYL1, XYL2/ARSdR, XKS1） | XR/XDH/ARSdR/XK | 催化 | 通过交配构建杂合二倍体SE12等 |
关键发现
- 分离的单倍体ENB2004和ENB3002木酮糖消耗速率分别为0.50和0.81 g/L/h，杂交菌株ENB4003为0.73 g/L/h，乙醇产率0.43 g/g。在YPX培养基（21 g/L木糖）中，SE12、MA-R5、MA-R4在72h分别产生5.80、5.65、4.82 g/L乙醇，木糖醇分泌分别为0.93、1.33、6.65 g/L（占消耗木糖的4.7%、6.7%、33%），乙醇产率分别为0.29、0.28、0.24 g/g。在YPDX培养基（45 g/L葡萄糖+45 g/L木糖）中，SE12和MA-R5完全消耗木糖，而MA-R4残留13 g/L木糖
- 木糖醇分泌占消耗木糖的10.9%、16.7%、50%
- 乙醇产量分别为23.3、22.8、18.1 g/L，乙醇产率分别为0.26、0.25、0.24 g/g。多数杂交菌株的ARSdR活性高于XDH活性，表明ARSdR更有利于木糖发酵。
研究结论
本研究成功分离了具有工业菌株IR-2遗传背景的木酮糖发酵单倍体，并证明其可用于木糖发酵酵母的育种。杂交菌株中ARSdR（NADP+依赖型XDH）比野生型XDH更有利于木糖同化，杂合菌株SE12与单基因整合的重组IR-2菌株MA-R5发酵性能相似，表明单倍体保留了IR-2的优良遗传背景。