Engineering the robustness of Saccharomyces cerevisiae by introducing bifunctional glutathione synthase gene
- 作者
- Zhiqi Qiu, Zujun Deng, Hongming Tan, Shining Zhou, Lixiang Cao
- 杂志
- Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology（2015）
- DOI
- 10.1007/s10295-014-1573-6
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
纤维素乙醇生产需要高耐受抑制物和高温的稳健酿酒酵母菌株，而常规菌株在预处理水解液中发酵性能差、乙醇产率低
研究策略
将来自嗜热链球菌的双功能谷胱甘肽合成酶基因GCSGS通过Cre-LoxP系统高拷贝整合到酿酒酵母核糖体DNA（rDNA）NTS2位点，并删除抗性标记，提高胞内GSH含量以增强对多种胁迫的耐受性
核心内容
本研究将来源于嗜热链球菌的双功能谷胱甘肽合成酶基因GCSGS，通过Cre-LoxP系统高拷贝整合至酿酒酵母BY4717核糖体DNA的NTS2位点并删除抗性标记，构建了无标记工程菌BY-G。该酶不受谷胱甘肽反馈抑制且不依赖氧化还原调控，使胞内GSH含量在60小时达到54.9 μmol/g DW，约为对照菌BY4741（11.7 μmol/g DW）的3倍，也远超GSH1过表达策略报道的水平。工程菌对3 mM H2O2、40 °C高温、10 mM糠醛、10 mM HMF和0.5 mM Cd²⁺的耐受性均显著提高，并能更快转化糠醛和HMF。在30%固含玉米秸秆同步糖化发酵中，BY-G在30小时乙醇浓度达20.6 g/L，约为对照的两倍，乙醇产率0.44 g/g葡萄糖，剩余葡萄糖仅2.4 g/L（对照为25.2 g/L），12小时乙醇生产速率达0.89 g/L/h。结果表明，引入双功能谷胱甘肽合成酶提升GSH积累是构建耐受抑制物和高温的稳健酿酒酵母菌株、适配纤维素原料同步糖化发酵的有效策略。
创新点
首次在酿酒酵母中引入不受GSH反馈抑制且不依赖氧化还原调控的双功能谷胱甘肽合成酶GCSGS，实现GSH超量积累；采用Cre-LoxP无标记整合，获得的工程菌GSH含量高达54.9 μmol/g DW，为报道的GSH1过表达策略（<12.2 μmol/g DW）的4.5倍
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae BY4717 | 谷胱甘肽生物合成 | GCSGS | 双功能谷胱甘肽合成酶GCSGS（源自嗜热链球菌） | 催化 | 通过Cre-LoxP系统高拷贝整合于rDNA NTS2位点；不受GSH反馈抑制和氧化还原调控，使GSH含量达54.9 μmol/g DW |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 谷胱甘肽生物合成 | GSH1 | γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（内源） | 催化 | 参照菌株内源GSH合成受产物反馈抑制，GSH含量仅11.7 μmol/g DW；用于对比工程菌性能 |
关键发现
- 工程菌BY-G胞内GSH含量在60 h达54.9 μmol/g DW，为参照菌BY4741（11.7 μmol/g DW）的3倍
- 对3 mM H2O2、40 °C、10 mM furfural、10 mM HMF和0.5 mM Cd2+的耐受性显著提高
- 在30%固含玉米秸秆SSF中，30 h乙醇浓度达20.6 g/L，乙醇产量0.44 g/g葡萄糖，剩余葡萄糖仅2.4 g/L（对照25.2 g/L），乙醇浓度约为对照的2倍
- 12 h乙醇生产速率0.89 g/L/h，24 h为0.73 g/L/h
- BY-G还能更快转化furfural和HMF（残留分别为0.1和0.7 g/L，对照为0.6和0.9 g/L）
研究结论
通过引入双功能谷胱甘肽合成酶基因GCSGS工程化酿酒酵母，显著提高胞内GSH含量，从而增强菌株对氧化胁迫、高温、糠醛、HMF和镉离子的耐受性，并在高固含同步糖化发酵中实现更高乙醇产量，该策略可用于构建适合纤维素原料SSF的稳健菌株