Biosynthesis of mercapturic acid derivative of the labdane-type diterpene, cyslabdan that potentiates imipenem activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus: cyslabdan is generated by mycothiol-mediated xenobiotic detoxification
- 作者
- Haruo Ikeda, Kazuo Shin-ya, Tohru Nagamitsu, Hiroshi Tomoda
- 单位
- Kitasato Institute for Life Sciences, Kitasato University; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology; School of Pharmacy, Kitasato University
- 杂志
- Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology（2015）
- DOI
- 10.1007/s10295-015-1694-6
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
阐明cyslabdan（一种增强亚胺培南抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌活性的labdane型二萜巯基尿酸衍生物）的生物合成基因簇及其生物合成途径，特别是巯基尿酸结构形成的机制。
研究策略
基于隐马尔可夫模型和Pfam搜索对产cyslabdan的Streptomyces cyslabdanicus K04-0144进行基因组挖掘，克隆推定cld基因簇；在工程化的Streptomyces avermitilis SUKA22中进行异源表达，采用组成型强启动子rpsJ提高产量；构建mca（mycothiol-S-缀合物酰胺酶）缺失突变体；结合HPLC/MS、NMR等代谢物分析鉴定中间产物和终产物，阐明生物合成路径。
核心内容
该研究通过基因组挖掘和异源表达，解析了cyslabdan A——一种能显著增强亚胺培南抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌活性的labdane型二萜巯基尿酸衍生物——的完整生物合成途径。研究者从Streptomyces cyslabdanicus K04-0144中克隆了包含cldA、cldB、cldC、cldD四个基因的cld基因簇，并在工程化的S. avermitilis SUKA22中异源表达，以组成型强启动子rpsJ驱动以提升产量。关键发现是cldC编码一个双功能细胞色素P450，同时催化C-7羟基化和C-8(17)环氧化，将前体labdatriene转化为关键中间体4。进一步的代谢物分析表明，中间体4与mycothiol发生非酶促亲核反应形成MSH-S-缀合物6，随后由mycothiol-S-缀合物酰胺酶Mca水解生成终产物cyslabdan A并分泌至胞外；mca缺失突变体在积累中间体4的同时丧失产1的能力，且可检测到缀合物6（HR-MS m/z 791.3975），直接证实了这一解毒途径。异源表达在2 L培养液中分别获得约15 mg 17-羟基-1和7 mg 2-羟基-1，菌丝体纯化得到约12 mg中间体4；cyslabdan A可将亚胺培南活性增强128至1000倍以上。该工作首次阐明巯基尿酸类天然产物通过mycothiol介导的外源物解毒机制生成的途径，并提示seongomycin、lactacystin等放线菌产物可能采用类似策略。
创新点
首次鉴定并异源表达了cyslabdan生物合成基因簇（cldABCD）；发现cldC编码双功能细胞色素P450，同时催化C-7羟基化和C-8(17)环氧化；揭示mycothiol介导的外源物解毒途径负责cyslabdan巯基尿酸结构的形成，即中间体4与mycothiol发生非酶促亲核反应形成MSH-S-缀合物，再由Mca水解生成1。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Streptomyces cyslabdanicus K04-0144 | cyslabdan生物合成 | cldA | CldA | 催化 | GGPP合酶，催化DMAPP和IPP缩合生成GGPP，含保守的HDDVM和AFQLRDDL基序 |
| Streptomyces cyslabdanicus K04-0144 | cyslabdan生物合成 | cldB | CldB | 催化 | (+)-copalyl二磷酸合酶（type-B萜烯合酶），催化GGPP环化生成(+)-copalyl二磷酸，含DxDDTA和QxxDGSW基序 |
| Streptomyces cyslabdanicus K04-0144 | cyslabdan生物合成 | cldC | CldC | 催化 | 双功能细胞色素P450，催化5的C-7羟基化和C-8(17)环氧化生成中间体4，含保守的半胱氨酸配体（RQCMG-） |
| Streptomyces cyslabdanicus K04-0144 | cyslabdan生物合成 | cldD | CldD | 催化 | labdatriene合酶（type-A萜烯合酶），催化(+)-copalyl二磷酸生成labda-8(17),12(E),14-triene（5），含DDMHGE和NDYYSWGRE基序 |
| Streptomyces anulatus GM95 | raimonol生物合成 | rmnA | RmnA | 催化 | GGPP合酶，与CldA有57%同源性，含HDDVM和AFQLRDDL基序 |
| Streptomyces anulatus GM95 | raimonol生物合成 | rmnB | RmnB | 催化 | (+)-copalyl二磷酸合酶（type-B萜烯合酶），与CldB有55%同源性，含DTDDTA和QSDDGSW基序 |
| Streptomyces anulatus GM95 | raimonol生物合成 | rmnC | RmnC | 催化 | 细胞色素P450，与CldC有66%同源性，主要催化5的C-7羟基化生成raimonol（7），环氧化活性较低，含RMCIG-基序 |
| Streptomyces anulatus GM95 | raimonol生物合成 | rmnD | RmnD | 催化 | labdatriene合酶（type-A萜烯合酶），与CldD有53%同源性，含DDAHGE和NDLASYAK基序 |
| Streptomyces avermitilis SUKA22（异源表达宿主）及其Δmca突变体 | mycothiol介导的解毒与cyslabdan生成 | mca | MSH-S-缀合物酰胺酶（Mca） | 催化 | 水解MSH-S-缀合物6中GlcN-Ins的酰胺键，释放巯基尿酸衍生物1；缺失后菌株不能产生1但积累4 |
关键发现
- cyslabdan A（1）可将亚胺培南对MRSA的活性增强128至1000倍以上，对青霉素类增强8-32倍，对头孢菌素类增强4-32倍
- 异源表达cld簇（pCLD102）的S. avermitilis SUKA22在2 L培养液中产生约15 mg的17-羟基-1（2）和7 mg的2-羟基-1（3），从菌丝体中纯化到约12 mg的新中间体4（(7S,8S,12E)-8,17-epoxy-7-hydroxy-labda-12,14-diene）
- 从pCLD104（ΔcldC）表达菌株获得约20 mg的labda-8(17),12(E),14-triene（5）
- 异源表达rmn簇产生raimonol（7，12 mg/2 L）和2-羟基-raimonol（8，7 mg/2 L）
- mca缺失突变株携带pCLD102不产生1，但菌丝中积累4，同时培养液和菌丝中均检测到MSH-S-缀合物6（HR-MS m/z 791.3975 [M+H]+，对应C37H63N2O14S），证实Mca负责将6水解为1。
研究结论
cyslabdan A的生物合成由cldA-cldB-cldC-cldD四个基因完成：CldA生成GGPP，CldB生成(+)-copalyl二磷酸，CldD生成labdatriene（5），CldC（双功能P450）将5转化为中间体4；随后4与mycothiol经非酶促反应形成MSH-S-缀合物6，由MSH-S-缀合物酰胺酶Mca水解生成巯基尿酸衍生物1并分泌至胞外。类似机制可能也存在于其他放线菌次生代谢产物如seongomycin、naphthomycin J和lactacystin的生物合成中。