Production of C4 and C5 branched-chain alcohols by engineered Escherichia. coli
- 作者
- Xiaoyan Chen, Jingliang Xu, Liu Yang, Zhenhong Yuan, Shiyuan Xiao, Yu Zhang, Cuiyi Liang, Minchao He, Ying Guo
- 单位
- China Center of Industrial Culture Collection; Guangzhou Institute of Energy Conversion, CAS; TransGen Biotech, Beijing; Novagen, Darmstadt, Germany
- 杂志
- Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology（2015）
- DOI
- 10.1007/s10295-015-1656-z
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何在大肠杆菌中实现C4和C5支链醇（异丁醇和3-甲基-1-丁醇）的高效生物合成，并探究关键酶的性质和发酵条件的影响。
研究策略
从乳酸乳球菌CICC 6246克隆支链α-酮酸脱羧酶基因kivd，从运动发酵单胞菌CICC 41465克隆醇脱氢酶基因adhB，共同转化至大肠杆菌BL21(DE3)，构建重组菌株；通过SDS-PAGE验证蛋白表达，利用LB和M9培养基进行发酵，考察温度、葡萄糖浓度、α-酮酸添加对醇产量的影响，并纯化Kivd测定其对不同底物的酶活。
核心内容
该研究构建了能在大肠杆菌中合成C4和C5支链醇的重组菌株。研究者从乳酸乳球菌CICC 6246克隆支链α-酮酸脱羧酶基因kivd，从运动发酵单胞菌CICC 41465克隆醇脱氢酶基因adhB，共同转化至大肠杆菌BL21(DE3)，通过SDS-PAGE确认蛋白表达后，利用LB和M9培养基考察温度、葡萄糖浓度及α-酮酸添加对醇产量的影响，并纯化Kivd测定底物特异性。结果显示，在LB培养基中3-甲基-1-丁醇产量达104 mg/L，显著高于异丁醇的24 mg/L；在含10 g/L葡萄糖的M9培养基中，异丁醇和3-甲基-1-丁醇产量分别达到211 mg/L和199 mg/L。添加α-酮异己酸可使异丁醇提高25%、3-甲基-1-丁醇提高17%。纯化的Kivd对α-酮异戊酸和α-酮异己酸的脱羧活性分别为26.77和21.24 μmol min⁻¹ mg⁻¹，表明该酶对两种底物具有相近的高催化活力。研究证实了该酶组合在支链醇生产中的适用性，调控葡萄糖浓度和前体添加可有效提升产量，为C4和C5支链醇的生物合成提供了可行的代谢工程策略。
创新点
首次使用乳酸乳球菌CICC 6246来源的Kivd与运动发酵单胞菌来源的AdhB组合在大肠杆菌中生产C4和C5支链醇；发现该重组菌株在LB培养基中3-甲基-1-丁醇产量显著高于异丁醇，不同于多数文献中异丁醇为主的报道；并表征了Kivd对底物KIV和KIC具有相近的脱羧活性。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | Ehrlich途径（支链氨基酸生物合成衍生途径） | kivd | 支链α-酮酸脱羧酶（Kivd） | 催化 | 来自乳酸乳球菌CICC 6246，催化α-酮异戊酸和α-酮异己酸脱羧生成相应醛 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | Ehrlich途径 | adhB | 醇脱氢酶（AdhB） | 催化 | 来自运动发酵单胞菌CICC 41465，催化醛还原为醇 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 缬氨酸/亮氨酸生物合成途径 | ilvCD、leuABCD（讨论中提及） | — | 催化 | 涉及α-酮异戊酸和α-酮异己酸前体合成，讨论中建议改造以增强C5醇产量 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 支链氨基酸转氨途径 | ilvE | 支链氨基酸转氨酶 | 调控 | 讨论中提及消除其末端抑制可能促进碳流向亮氨酸合成 |
关键发现
- 重组菌株在LB培养基中3-甲基-1-丁醇产量为104 mg/L，异丁醇为24 mg/L
- 在含5 g/L葡萄糖的M9培养基中，异丁醇和3-甲基-1-丁醇产量分别为156 mg/L和161 mg/L
- 在10 g/L葡萄糖下，最大产量分别为211 mg/L和199 mg/L。添加KIV使异丁醇产量提高23%，添加KIC使异丁醇提高25%，使3-甲基-1-丁醇提高17%。纯化Kivd对α-酮异戊酸(KIV)和α-酮异己酸(KIC)的脱羧活性分别为26.77和21.24 μmol min⁻¹ mg⁻¹。kivd基因长1647 bp，adhB基因长1152 bp。
研究结论
通过在大肠杆菌中异源表达乳酸乳球菌Kivd和运动发酵单胞菌AdhB，成功实现了异丁醇和3-甲基-1-丁醇的合成。该Kivd对KIV和KIC均具有较高且相近的脱羧活力，因此重组菌株在C4和C5支链醇生产方面具有应用潜力。提高葡萄糖浓度和添加α-酮酸前体可显著提高醇产量。