Influence of methanol/sorbitol co-feeding rate on pAOX1 induction in a Pichia pastoris Mut+ strain in bioreactor with limited oxygen transfer rate
- 作者
- F. Carly, H. Niu, F. Delvigne, P. Fickers
- 单位
- Unité de Biotechnologies et Bioprocédés, Université libre de Bruxelles, Av Roosevelt 52, CP152/51, 1050 Brussels, Belgium; Department of Chemical Engineering, Centre for Process Systems Engineering, Imperial College London, South Kensington Campus, London SW7 2AZ, England, UK; Microbial Processes and Interactions, Université de Liège-Gembloux AgroBio Tech, Passage des Déportés, 2, 5030 Gembloux, Belgium
- 杂志
- Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology（2016）
- DOI
- 10.1007/s10295-015-1722-6
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在氧传递受限的大型生物反应器条件下，甲醇/山梨醇共喂养速率如何影响毕赤酵母Mut+菌株的pAOX1启动子诱导水平，以及氧限制和甲醇积累对诱导的分别影响。
研究策略
采用恒化培养，保持稀释率恒定，逐步提高甲醇/山梨醇混合碳源的总碳喂养速率（4.4-7.7 mmol C gDCW^-1 h^-1），将氧传递速率控制在工业规模典型范围（约5-10 g O2 L^-1 h^-1），利用pAOX1-lacZ报告基因定量启动子活性，并测定细胞生长、甲醇/山梨醇消耗、溶解氧和氧摄取速率。
核心内容
本研究在氧传递受限、接近工业规模的生物反应器条件下，以毕赤酵母Mut+菌株为对象，系统考察了甲醇/山梨醇共喂养速率对pAOX1启动子诱导水平的影响。通过恒化培养保持稀释率恒定，逐步提高总碳喂养速率（4.4–7.7 mmol C gDCW⁻¹ h⁻¹），并利用pAOX1-lacZ报告基因定量启动子活性。结果表明，当溶解氧大于零时，提高碳喂养速率可增强pAOX1诱导；而当氧完全耗尽时，甲醇积累导致诱导水平下降约30%，β-半乳糖苷酶比活性从2.01×10⁴ MU降至1.27×10⁴ MU。研究进一步区分了甲醇积累与低溶解氧的各自影响，指出甲醇积累是抑制诱导的关键因素。在KLa=712 h⁻¹条件下，最佳碳喂养速率为6.6 mmol C gDCW⁻¹ h⁻¹，此时氧传递速率为8.28 g O₂ (L h)⁻¹，β-半乳糖苷酶总活性达4.75×10⁶ U/mL，较先前工作提高5倍以上，生物量达59 gDCW/L。这些结果明确了甲醇/山梨醇共喂养速率对pAOX1诱导的定量调控规律，强调在工业规模氧受限条件下，避免甲醇过量积累比维持高溶解氧更为关键，为异源蛋白生产的过程优化提供了重要依据。
创新点
['首次在氧传递受限且接近工业规模的条件下系统研究碳喂养速率对pAOX1诱导的定量影响', '区分了甲醇积累与低溶解氧对pAOX1诱导的抑制作用，指出甲醇积累是更关键的因素', '确定了在KLa=712 h^-1的反应器中最佳碳喂养速率为6.6 mmol C gDCW^-1 h^-1，并给出相应的氧传递速率条件', '证明甲醇/山梨醇共喂养使细胞能适应氧瞬变限制，且对pAOX1诱导影响较小']
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris GS115 (Mut+) | 甲醇代谢通路 | AOX1 | 醇氧化酶1 | 催化 | 甲醇氧化关键酶，其启动子pAOX1受甲醇严格诱导，是本研究主要调控目标 |
| Pichia pastoris GS115 (Mut+) | 报告基因系统 | lacZ | β-半乳糖苷酶 | 催化 | 作为pAOX1启动子活性的报告蛋白，通过Miller法测定酶活量化诱导水平 |
| Pichia pastoris GS115 (Mut+) | 甲醇代谢调控 | pAOX1 | — | 调控 | 启动子元件，受甲醇诱导，受碳喂养速率和溶解氧水平影响，是研究核心 |
关键发现
- 在DO>0时，增加碳喂养速率提高pAOX1诱导
- 在DO完全耗尽时，甲醇积累导致pAOX1诱导降低30%（β-半乳糖苷酶比活性从2.01×10^4 MU降至1.27×10^4 MU，总活性从4.75×10^6 U/mL降至3.23×10^6 U/mL）。最佳碳喂养速率为6.6 mmol C gDCW^-1 h^-1，此时OTR为8.28 g O2 (L h)^-1，pAOX1诱导比先前工作提高5倍以上（β-半乳糖苷酶总活性从0.92×10^6 U/mL升至4.75×10^6 U/mL）。生物量从49 gDCW/L增至63 gDCW/L，其中最优条件下生物量达到59 gDCW/L，比先前研究提高2.6倍。甲醇积累浓度约10 g/L时没有影响细胞生长，但导致pAOX1诱导下降。qO2在氧充足到氧限制时增加13%（从0.122到0.138 g DCW^-1 h^-1）。
研究结论
甲醇/山梨醇共喂养速率直接影响pAOX1启动子诱导水平与异源蛋白产量。在好氧或拟好氧条件下，提高碳喂养速率能增强pAOX1诱导；但在缺氧条件下，甲醇积累是导致诱导下降的主要因素，而非低溶解氧本身。对于KLa=712 h^-1的大型反应器，最佳碳喂养速率为6.6 mmol C gDCW^-1 h^-1。避免甲醇大量积累比维持高溶解氧更为关键。