Engineering of Saccharomyces cerevisiae to utilize xylan as a sole carbohydrate source by co-expression of an endoxylanase, xylosidase and a bacterial xylose isomerase
- 作者
- Marlin John Mert, Daniël Coenrad la Grange, Shaunita Hellouise Rose, Willem Heber van Zyl
- 杂志
- Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology（2016）
- DOI
- 10.1007/s10295-015-1727-1
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
酿酒酵母天然无法降解木聚糖也不能代谢木糖，导致木质纤维素生物质中木聚糖组分难以被利用，影响生物乙醇生产的经济性。
研究策略
在酿酒酵母中共表达来自里氏木霉的内切木聚糖酶基因xyn2、来自黑曲霉的木糖苷酶基因xlnD、来自多形拟杆菌的密码子优化木糖异构酶基因xylA和来自树干毕赤酵母的木酮糖激酶基因xyl3，并敲除非特异性醛还原酶基因GRE3以减少木糖醇积累，从而构建能够以木聚糖为唯一碳源生长并发酵木糖产乙醇的重组菌株。
核心内容
本研究在酿酒酵母Y294中构建了能够以木聚糖为唯一碳源生长并发酵产乙醇的重组菌株Y294[YMX1]。研究者共表达了来自里氏木霉的内切木聚糖酶基因xyn2、黑曲霉的木糖苷酶基因xlnD、多形拟杆菌的密码子优化木糖异构酶基因xylA以及树干毕赤酵母的木酮糖激酶基因xyl3，同时敲除非特异性醛还原酶基因GRE3以减少木糖醇积累。通过木糖异构酶途径避免了传统XR/XDH途径的氧化还原失衡。结果表明，该菌株在木糖上的最大比生长速率约0.06 g/g/h，有氧条件下木糖培养159 h生物量产率达0.52 g DCW/g木糖，显著高于葡萄糖培养的0.21 g DCW/g葡萄糖。在氧限制条件下，YMX1消耗约20 g/L木糖产生约9 g/L乙醇，达理论产率的约90%。在以山毛榉木聚糖为唯一碳源的培养中，对照菌株积累木糖约12.7 g/L，而YMX1能有效消耗木糖用于生长。该菌株为木质纤维素生物乙醇生产提供了可行方案，但木糖异构酶活性仍需进一步提升以缩短发酵周期。
创新点
首次在酿酒酵母中利用密码子优化的多形拟杆菌木糖异构酶与游离木聚糖降解酶共表达，实现以聚合物木聚糖为唯一碳源的生长；采用木糖异构酶途径避免传统XR/XDH途径的氧化还原失衡；敲除GRE3降低木糖醇副产物。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae Y294 | 木聚糖降解 | xyn2 | 内切木聚糖酶 II (Xyn2) | 催化 | 来自 Trichoderma reesei，分泌表达，水解木聚糖主链 |
| Saccharomyces cerevisiae Y294 | 木聚糖降解 | xlnD | β-木糖苷酶 (XlnD) | 催化 | 来自 Aspergillus niger，将木寡糖水解为木糖 |
| Saccharomyces cerevisiae Y294 | 木糖代谢 | xylA | 木糖异构酶 (XylA) | 催化 | 来自 Bacteroides thetaiotaomicron，密码子优化后表达，将木糖直接异构化为木酮糖，活性二聚体约110 kDa，最适温度65°C，最适pH 7.5 |
| Saccharomyces cerevisiae Y294 | 木糖代谢 | xyl3 | 木酮糖激酶 (Xyl3) | 催化 | 来自 Scheffersomyces stipitis，磷酸化木酮糖生成木酮糖-5-磷酸 |
| Saccharomyces cerevisiae Y294 | 木糖代谢 | GRE3 | 非特异性醛糖还原酶 (Gre3) | 调控 | 敲除以减少木糖醇副产物积累，但仍有少量木糖醇产生，提示存在其他醛糖还原酶 |
关键发现
- 重组菌株Y294[YMX1]在木糖上最大比生长速率约0.06 g/g/h
- 有氧条件下木糖培养159 h生物量产率约0.52 g DCW/g木糖，显著高于葡萄糖培养32 h的0.21 g DCW/g葡萄糖
- 胞外内切木聚糖酶活性在葡萄糖和木糖上分别达到约198和234 nkat/mL/g生物量（32 h和159 h），在木糖上培养82 h和345 h时分别约422和404 nkat/mL/g生物量
- 氧限制条件下，该菌株消耗约20 g/L木糖并产生约9 g/L乙醇，达到理论乙醇产率的约90%
- 在以山毛榉木聚糖为唯一碳源的有氧培养中，YMX1菌株能够生长并利用木聚糖，而对照菌株Y294[XYN2 XLO2]积累木糖约12.7 g/L，YMX1菌株木糖浓度低，表明木糖被消耗用于生物量合成。
研究结论
成功构建了能利用木聚糖作为唯一碳源的酿酒酵母菌株Y294[YMX1]，该菌株通过分泌游离的木聚糖酶和木糖苷酶水解木聚糖，并利用细菌木糖异构酶途径同化木糖，在氧限制条件下可实现约90%理论乙醇产率，为木质纤维素生物乙醇生产提供了有前景的候选菌株，但仍需进一步提高木糖异构酶活性以缩短发酵时间。