Combinatorial metabolic pathway assembly in the yeast genome with RNA-guided Cas9
- 作者
- Steve F. EauClaire, Jianzhong Zhang, Corban Gregory Rivera, Lixuan L. Huang
- 单位
- Industrial Biosciences, E. I. Du Pont Company, Wilmington, DE, USA
- 杂志
- Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology（2016）
- DOI
- 10.1007/s10295-016-1776-0
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在酿酒酵母中利用RNA-guided Cas9实现多条代谢途径DNA片段的一步组装与染色体整合，并构建组合文库以快速优化代谢途径，解决传统逐步整合和标记回收耗时的问题。
研究策略
利用RNA-guided Cas9在基因组特定座位产生双链断裂，通过同源重组将多个50 bp重叠的DNA片段（启动子-基因-终止子）直接组装并整合到基因组；进一步通过为每个基因提供两个不同的启动子，构建组合表达文库，筛选高产菌株。
核心内容
本研究利用RNA-guided Cas9系统在酿酒酵母基因组中实现了代谢途径DNA片段的一步组装与整合。通过在CAN1座位诱导双链断裂，借助同源重组将多个50 bp重叠片段直接组装入基因组，成功一步整合了17个片段（总长11.8 kb），效率约17%，并实现了无选择标记的整合。在二倍体中，HO.G sgRNA引导的Cas9达到100%双等位基因删除效率。进一步针对β-胡萝卜素途径的crtY、crtI、crtB三个基因各提供两个不同启动子，构建了组合表达文库，16/22个转化子确认整合并覆盖7/8种启动子组合，多数克隆β-胡萝卜素产量较第一代菌株提升达4倍。该工作建立了一种单步、无标记、组合式的途径组装工具，大幅缩短了菌株构建周期，为多种生物合成途径的快速筛选与优化提供了通用平台。
创新点
1) 首次在酵母基因组中直接组装多达17个重叠DNA片段；2) 无需选择标记的一步整合；3) 构建了染色体整合的组合启动子文库，实现途径表达的快速筛选。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae BP1548 | β-胡萝卜素生物合成 | crtE | GGPP合酶 (geranylgeranyl diphosphate synthase) | 催化 | 来自Yarrowia lipolytica表达质粒，催化FPP转化为GGPP |
| Saccharomyces cerevisiae BP1548 | β-胡萝卜素生物合成 | crtB | 八氢番茄红素脱氢酶 (phytoene desaturase) | 催化 | 来自Yarrowia lipolytica表达质粒，参与脱氢反应 |
| Saccharomyces cerevisiae BP1548 | β-胡萝卜素生物合成 | crtI | 神经孢红素脱氢酶-番茄红素合酶 (neurosporene desaturase-lycopene synthase) | 催化 | 来自Yarrowia lipolytica表达质粒，催化多步脱氢 |
| Saccharomyces cerevisiae BP1548 | β-胡萝卜素生物合成 | crtY | 番茄红素环化酶 (lycopene cyclase) | 催化 | 催化番茄红素环化生成β-胡萝卜素 |
| Saccharomyces cerevisiae BP1548 | 甲羟戊酸途径 | tHMG1 | HMG-CoA还原酶催化域 | 催化 | 截短的可溶性Hmg1，解除产物抑制，增加FPP通量 |
| Saccharomyces cerevisiae BP1548 | 基因组编辑（工具） | Cas9 | RNA引导的Cas9核酸酶 | 催化 | 在sgRNA引导下产生双链断裂，促进同源重组修复 |
关键发现
- 利用RNA-guided Cas9在酿酒酵母CAN1位点一步组装并整合了17个重叠DNA片段（总长11.8 kb），效率约17%（4/24）
- CAN1 ORF删除效率44%
- 在二倍体菌株中HO.G sgRNA实现100%双等位基因ORF删除
- 构建的β-胡萝卜素组合表达文库（crtY/crtI/crtB各配两个启动子）中，16/22个转化子确认整合，覆盖7/8种启动子组合，多数克隆β-胡萝卜素产量较第一代菌株PX1213提高达4倍。
研究结论
本研究建立了基于RNA-guided Cas9的单步、无标记、组合式代谢途径组装和基因组整合工具箱，显著加速了酿酒酵母代谢工程的菌株构建与优化，可广泛应用于多种生物合成途径的快速筛选和优化。