A high-throughput screening strategy for accurate quantification of menaquinone based on fluorescence-activated cell sorting
- 作者
- Yan Liu, Zheng-lian Xue, Shao-peng Chen, Zhou Wang, Yong Zhang, Wei-liang Gong, Zhi-ming Zheng
- 杂志
- Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology（2016）
- DOI
- 10.1007/s10295-016-1757-3
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
缺乏准确、高通量筛选高产甲萘醌（维生素K2）菌株的方法。传统方法耗时费力，且MK产生菌无明显表型变化或抑菌效果，常规筛选手段难以适用。
研究策略
利用罗丹明123（Rh123）荧光染料反映细胞膜电位，通过膜电位与甲萘醌含量的关联，结合荧光激活细胞分选（FACS）实现高通量定量检测。优化了细胞通透化处理（蔗糖休克）、染色缓冲液、染料浓度、孵育和储存时间等条件，并用HPLC验证荧光强度与MK含量的相关性。
核心内容
针对甲萘醌（维生素K2）高产菌株缺乏准确高通量筛选方法的问题，本研究建立了一种基于荧光激活细胞分选（FACS）的新型筛选策略。该策略利用罗丹明123（Rh123）染料报告细胞膜电位，通过膜电位与甲萘醌含量的内在关联实现目标代谢物的间接定量。研究人员以黄杆菌属FM2-6为对象，系统优化了蔗糖休克通透化处理、染色缓冲液、染料浓度及孵育时间等条件，其中10%蔗糖浓度维持了23%的细胞存活率，Rh123最佳用量为5 μg/mL。经HPLC验证，细胞荧光强度与甲萘醌含量在28–125 mg/L范围内呈现高度线性相关，相关系数R²达0.9869；分选后的30株突变体经HPLC复测，其甲萘醌含量与荧光信号趋势一致。该方法每小时可分析超过5万个细胞，且荧光信号在60分钟内保持初始强度的87.6%，兼具通量与稳定性。该工作首次将FACS引入甲萘醌高产菌株筛选，为缺乏明显表型变化的工业微生物菌株改良提供了可借鉴的通用筛选范式。
创新点
首次将FACS应用于甲萘醌高产菌株的高通量筛选；建立了Rh123染色荧光信号与MK含量的定量关系（R²=0.9869）；优化了蔗糖渗透处理提高细胞通透性、MgCl2预处理提高存活率等染色方案，使荧光信号与MK含量准确关联。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Flavobacterium sp. FM2-6 | 甲萘醌（维生素K2）生物合成及呼吸电子传递链 | — | — | 能量供给 | 目标菌株，高产甲萘醌，通过离子束注入构建突变库 |
| Flavobacterium sp. FM2-6 | 细胞膜电子传递链 | — | — | 能量供给 | 甲萘醌通过氧化还原反应参与跨膜电势形成，被Rh123荧光定量检测 |
关键发现
- 优化后蔗糖休克处理获得最高平均荧光133.29±4.23，对照1（染料无细胞）为0.82±0.08，对照2（未染色细胞）为15.46±1.08，对照3（非感受态染色）为16.18±1.23
- 10%蔗糖浓度维持细胞存活率23%，平均荧光133.29±4.23
- 荧光强度与HPLC测得的MK含量相关系数R²=0.9869
- FACS每小时可分析超过5万个细胞（50,000 cells/h）
- 荧光强度在60分钟内保持初始强度的87.6%
- 最佳Rh123浓度为5 μg/mL（细胞密度5×10⁴ cells/mL）
- MK含量在28–125 mg/L范围内时，几何平均荧光与HPLC值相关R²=0.98
- 30株分选突变体的HPLC测得MK含量与荧光强度趋势一致。
研究结论
成功开发了一种基于FACS和Rh123染色的高通量定量筛选方法，可用于黄杆菌属（Flavobacterium sp.）高产甲萘醌突变体的筛选，并为其他工业微生物菌株的筛选提供参考。