High level extracellular production of a truncated alkaline β-mannanase from alkaliphilic Bacillus sp. N16-5 in Escherichia coli by the optimization of induction condition and fed-batch fermentation
- 作者
- Hongchen Zheng, Zhenxiao Yu, Xiaoping Fu, Shufang Li, Jianyong Xu, Hui Song, Yanhe Ma
- 单位
- Industrial Enzymes National Engineering Laboratory, Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences; Tianjin Key Laboratory for Industrial Biological Systems and Bioprocessing Engineering, Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences
- 杂志
- Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology（2017）
- DOI
- 10.1007/s10295-016-1773-3
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
提高嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp. N16-5碱性β-甘露聚糖酶在大肠杆菌中的胞外表达水平，解决低产量和分泌效率不足的问题。
研究策略
对甘露聚糖酶基因进行C端截短（去除碳水化合物结合域CBD），构建pET32a和pET22b四种表达载体，筛选出分泌性能更好的截短酶；随后在摇瓶水平优化诱导温度、IPTG浓度和渗透质（Triton X-100等），并在10 L发酵罐中采用一次性补料和Triton X-100添加策略实现高水平胞外生产。
研究路线图
核心内容
该研究通过基因截短与发酵条件优化，实现了嗜碱芽孢杆菌来源碱性β-甘露聚糖酶在大肠杆菌中的高水平胞外分泌。作者去除甘露聚糖酶C端碳水化合物结合域，构建了四种pET32a/pET22b载体，筛选出分泌性能显著提升的截短酶ManAR2。实验表明，截短酶较全长酶的分泌率和稳定性更高，其中22b-ManAR2的比活力达3225.32 U/mg，为全长酶的2.7倍。摇瓶培养在25°C、0.05 mM IPTG和0.1% Triton X-100条件下，22b-ManAR2的可溶酶活达到6823.38 U/mL。进一步在10 L发酵罐中采用一次性补料16 g/L甘油并结合Triton X-100添加，46小时总可溶酶活达9284.64 U/mL，其中胞外酶活6892.42 U/mL，胞外率74%。该工作首次报道截短策略显著改善酶的分泌性与稳定性，并通过过程优化实现了迄今报道的最高胞外碱性β-甘露聚糖酶产量，为工业应用提供了低成本高效的制备途径。
创新点
首次报道截短酶（ManAR2）较全长酶（ManAR1）具有更高的分泌率、热稳定性和碱稳定性；通过一次性补料和Triton X-100添加，在10 L发酵罐中达到迄今报道的最高胞外碱性β-甘露聚糖酶产量。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | β-甘露聚糖酶异源表达通路 | manAR1 | ManAR1 (32a-ManAR1/22b-ManAR1) | 催化 | 全长碱性β-甘露聚糖酶，含碳水化合物结合域(CBD)，经pET32a或pET22b表达。 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | β-甘露聚糖酶异源表达通路 | manAR2 | ManAR2 (32a-ManAR2/22b-ManAR2) | 催化 | 截短碱性β-甘露聚糖酶，缺失C端CBD，具有更高分泌率、热稳定性和碱稳定性。 |
| Escherichia coli DH5α | 基因克隆 | manAR1/manAR2 | — | 调控 | DH5α用于重组质粒的克隆和保存，不参与蛋白表达。 |
关键发现
- 截短酶32a-ManAR2和22b-ManAR2的分泌率分别为59.8%和55.7%，较各自全长酶提高1.2倍
- 22b-ManAR2的比活力为3225.32 U/mg，是22b-ManAR1的2.7倍
- kcat/Km高达602.7 mL/mg s。摇瓶优化后，32a-ManAR2和22b-ManAR2在25°C、0.05 mM IPTG、0.1% Triton X-100条件下最高可溶酶活分别达3646.21 U/mL和6823.38 U/mL。在10 L发酵罐中，采用一次性补料（16 g/L甘油）和0.1% Triton X-100添加，46 h时总可溶甘露聚糖酶活性达9284.64 U/mL，胞外酶活为6892.42 U/mL，胞外率为74%。
研究结论
截短碱性β-甘露聚糖酶ManAR2不仅具有更好的分泌性和稳定性，而且通过优化诱导条件和补料策略，在大肠杆菌BL21(pET22b-manAR2)中实现了迄今最高的胞外产量，展现出良好的工业应用潜力。