Metabolic engineering of Rhodopseudomonas palustris for squalene production
- 作者
- Wen Xu, Changbin Chai, Lingqiao Shao, Jia Yao, Yang Wang
- 杂志
- Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology（2017）
- DOI
- 10.1007/s10295-016-1745-7
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
微生物产角鲨烯产量不足，需要开发新的宿主和策略以提高角鲨烯产量。
研究策略
以沼泽红假单胞菌TIE-1为宿主，通过敲除shc基因阻断类何帕烷分支途径、融合表达crtE与hpnD构建底物通道、过表达dxs基因增强MEP途径代谢通量，组合多种策略提高角鲨烯产量。
研究路线图
核心内容
该研究以沼泽红假单胞菌TIE-1为宿主，通过多策略组合代谢工程提高角鲨烯产量。首先敲除shc基因阻断类何帕烷分支途径，使角鲨烯产量达3.8 mg/g DCW，较野生型提高27倍；随后分别或组合过表达crtE和hpnD，其中融合表达CrtE-HpnD（以(GGGGS)3连接肽构建底物通道）比共表达更有效，产量达12.6 mg/g DCW，较共表达法提高27.4%；在此基础上进一步过表达dxs强化MEP途径通量，最终角鲨烯产量达到15.8 mg/g DCW，相比野生型提高112倍。研究首次在沼泽红假单胞菌中验证了阻断竞争途径、构建底物通道与增强前体供给三类策略的协同效应，表明该菌株具备作为角鲨烯生产宿主的潜力，融合表达策略也为其他萜类产物的代谢工程改造提供了参考。
创新点
首次在Rhodopseudomonas palustris中通过多策略组合提高角鲨烯产量；利用(GGGGS)3连接肽融合表达CrtE和HpnD构建底物通道，证明融合表达优于共表达；阻断类何帕烷合成途径并结合MEP途径强化。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Rhodopseudomonas palustris TIE-1 | 类何帕烷合成途径 | shc | 角鲨烯何帕烯环化酶 | 催化 | 敲除该基因阻断角鲨烯向类何帕烷转化，使角鲨烯积累 |
| Rhodopseudomonas palustris TIE-1 | 萜类前体合成途径（MEP途径下游） | crtE | 牻牛儿牻牛儿焦磷酸合酶 | 催化 | 过表达增强FPP合成，单独过表达使角鲨烯提高2.1倍 |
| Rhodopseudomonas palustris TIE-1 | 角鲨烯合成途径 | hpnD | HpnD（角鲨烯合成相关酶） | 催化 | 过表达使角鲨烯提高83%；与crtE共表达及融合表达以增强FPP向角鲨烯途径的转化 |
| Rhodopseudomonas palustris TIE-1 | MEP途径 | dxs | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 | 催化 | 过表达增强IPP/DMAPP供给，使角鲨烯产量进一步提高 |
| Escherichia coli DH5α | — | — | — | 催化 | 用于质粒扩增的宿主 |
| Escherichia coli S17-1 | — | — | — | 调控 | 用于基因敲除的供体菌 |
关键发现
- 敲除shc基因后角鲨烯产量达3.8 mg/g DCW，比野生型提高27倍
- 化学异养和光养条件下分别提高22倍和28倍。共表达crtE和hpnD使角鲨烯产量达9.9 mg/g DCW，比shc敲除株提高1.6倍
- 单独过表达crtE提高2.1倍，过表达hpnD提高83%。融合表达crtE-hpnD使角鲨烯产量达12.6 mg/g DCW，比共表达法提高27.4%，比shc敲除株提高3.3倍。进一步共表达dxs后角鲨烯产量达15.8 mg/g DCW，比融合表达株提高25.4%，相比野生型提高112倍。
研究结论
阻断类何帕烷合成途径、融合表达CrtE-HpnD构建底物通道以及过表达dxs增强MEP途径代谢通量，可协同提高Rhodopseudomonas palustris的角鲨烯产量，最终产量达15.8 mg/g DCW，证明该菌株具有生产角鲨烯的潜力。