Probing the bioethanol production potential of Scheffersomyces (Pichia) stipitis using validated genome-scale model
- 作者
- Lisha K. Parambil, Debasis Sarkar
- 单位
- Department of Chemical Engineering, Indian Institute of Technology Kharagpur, Kharagpur 721 302, India
- 杂志
- Biotechnology Letters（2014）
- DOI
- 10.1007/s10529-014-1629-8
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何通过系统策略提高Scheffersomyces stipitis利用葡萄糖和木糖混合物生产生物乙醇的产量和生产力。
研究策略
利用已验证的基因组规模代谢模型，通过动态通量平衡分析(dFBA)模拟单培养和共培养发酵，评估培养基添加氨基酸、批式/补料分批操作、与重组大肠杆菌ZSC113共培养以及对其基因改造等方式对乙醇生产的影响。
核心内容
本研究利用Scheffersomyces stipitis的基因组规模代谢模型，结合动态通量平衡分析系统评估了多种提高生物乙醇产量的策略。在标准培养基批式发酵（16 g/L葡萄糖加8 g/L木糖）中，24小时产乙醇9.6 g/L，得率0.4 g/g；添加L-天冬酰胺等9种氨基酸可使产量提升5.5%–11.4%，其中L-天冬酰胺效果最佳。补料分批操作优势明显，在100 g总糖条件下得率较批式提高37.5%，260 g总糖时120小时产乙醇114 g，得率0.46 g/g，达理论最大值90%。与重组大肠杆菌ZSC113共培养（9:1接种比）在60小时产乙醇95.6 g，生产力较单培养提高67.3%，但得率下降19.5%。对ZSC113进行Δgdh和Δack基因改造后，共培养产乙醇106 g，得率0.42 g/g，生产力1.78 g/h，ZSC113自身乙醇产量从1.01 g/L增至3.51 g/L，副产物乙酸和甲酸分别降至0.015 g/L和0.18 g/L。结果表明基因组规模代谢模型能有效指导菌株筛选和发酵工艺优化，通过培养基补充、补料分批操作及共培养工程改造可显著提升S. stipitis的乙醇生产性能。
创新点
系统性地结合dFBA模型筛选多种增产策略；发现特定氨基酸可提高乙醇产率；提出顺序补料分批共培养方案以克服木糖摄取慢和乙醇抑制问题；通过基因删除改造ZSC113进一步提高共培养的乙醇产量。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Scheffersomyces stipitis | 木糖代谢/乙醇发酵 | — | — | 催化 | 野生型木糖发酵酵母，本研究的核心底盘菌株 |
| Escherichia coli ZSC113 | 混合酸发酵/乙醇生产 | — | — | 催化 | 木糖选择性重组菌株，通过限制葡萄糖交换和葡萄糖激酶通量为零构建，用于共培养快速消耗木糖 |
| Escherichia coli ZSC113 | 谷氨酸代谢 | gdh | 谷氨酸脱氢酶 | 催化 | 基因删除策略之一，与ack双删效果最佳 |
| Escherichia coli ZSC113 | 乙酸代谢 | ack | 乙酸激酶 | 催化 | 基因删除策略之一，与gdh双删显著提高乙醇产量 |
| Escherichia coli ZSC113 | 丙酮酸代谢 | pfl | 丙酮酸甲酸裂解酶 | 催化 | 基因删除策略之一，Δgdh+Δpfl使共培养生产力提高86.7% |
| Escherichia coli ZSC113 | 乙酸代谢 | pta | 磷酸转乙酰酶 | 催化 | 基因删除策略之一，减少乙酸副产物 |
| Escherichia coli ZSC113 | 三羧酸循环 | fum | 延胡索酸酶 | 催化 | 基因删除策略之一 |
| Escherichia coli ZSC113 | 磷酸戊糖途径 | gnd | 磷酸葡糖酸脱氢酶 | 催化 | 基因删除策略之一 |
| Escherichia coli ZSC113 | 叶酸代谢 | mthfd | 亚甲基四氢叶酸脱氢酶 | 催化 | 基因删除策略之一 |
| Escherichia coli ZSC113 | 氨甲酰磷酸代谢 | cbm | 氨甲酸激酶 | 催化 | 基因删除策略之一 |
关键发现
- 标准培养基下批式发酵（16 g/L葡萄糖+8 g/L木糖，0.4 g/L接种量）24 h产乙醇9.6 g/L，乙醇得率0.4 g/g
- 添加L-天冬酰胺等9种氨基酸可使乙醇产量提高5.5%-11.4%，其中L-天冬酰胺效果最佳。补料分批相比批式发酵在高糖浓度下优势明显：40 g总糖时得率提高5%，100 g总糖时提高37.5%。单培养补料分批发酵（260 g总糖）120 h产乙醇114 g（23 g/L），乙醇得率0.46 g/g，生产力0.95 g/h，得率为理论最大值的90%。与ZSC113共培养（接种比例9:1，60 h）产乙醇95.6 g（19.1 g/L），得率0.37 g/g，生产力1.59 g/h，生产力比单培养提高67.3%，但得率降低19.5%。对ZSC113进行基因改造（Δgdh+Δack）后共培养产乙醇106 g（21.2 g/L），得率0.42 g/g，生产力1.78 g/h，ZSC113乙醇产量从1.01 g/L增至3.51 g/L，总得率和生产力分别提高13.5%和11.9%，同时副产物乙酸和甲酸显著降至0.015 g/L和0.18 g/L。
研究结论
基因组规模代谢模型是筛选和设计具有优良性状菌株的高价值工具。研究表明通过培养基优化、补料分批操作以及与基因改造的E. coli ZSC113共培养可显著提升S. stipitis的生物乙醇生产性能。