Biosynthesis of pinene from glucose using metabolically-engineered Corynebacterium glutamicum
- 作者
- Min-Kyoung Kang, Jin-Hee Eom, Yunje Kim, Youngsoon Um, Han Min Woo
- 单位
- Clean Energy Research Center, Korea Institute of Science and Technology; Department of Chemistry, Korea University; Department of Clean Energy and Chemical Engineering, Korea University of Science and Technology; Green School, Korea University
- 杂志
- Biotechnology Letters（2014）
- DOI
- 10.1007/s10529-014-1578-2
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）中实现以葡萄糖为底物生物合成蒎烯，并解决蒎烯的细胞毒性及产量低的问题。
研究策略
利用CoryneBrick载体在C. glutamicum中异源表达来自火炬松（Pinus taeda）和北美冷杉（Abies grandis）的蒎烯合成酶（PS）与香叶基二磷酸合成酶（GPPS），同时过表达内源的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶（Dxs）和异戊烯基二磷酸异构酶（Idi），并通过十二烷覆盖层建立两相原位萃取系统以消除产物毒性。
核心内容
本研究通过代谢工程在谷氨酸棒杆菌中实现了以葡萄糖为底物的蒎烯生物合成，属该菌种中的首次报道。利用CoryneBrick载体异源表达了来自火炬松和北美冷杉的蒎烯合成酶及香叶基二磷酸合成酶，同时过表达内源1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶和异戊烯基二磷酸异构酶以强化MEP途径的前体供应。研究发现，共表达DXS和IDI与火炬松PS及北美冷杉GPPS1时，α-蒎烯产量达27±7 μg/g细胞干重。针对蒎烯的细胞毒性，外源添加0.25%至1%蒎烯可使生长速率降至对照的20%，而构建20%十二烷覆盖层的两相原位萃取系统后，菌株生长恢复正常且产物可被有效萃取。该策略虽产量仍较低，但验证了通过前体强化和产物原位移除缓解毒性的可行性，为后续通过蛋白工程改造关键酶和优化中央代谢通路提升产量奠定了基础。
创新点
['首次在谷氨酸棒杆菌中实现蒎烯生物合成', '建立基于十二烷覆盖层的两相原位萃取培养系统', '组合过表达内源Dxs和Idi提高IPP前体供应']
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 | MEP途径 | dxs | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶 | 催化 | 内源基因，过表达以增强IPP前体供应 |
| Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 | MEP途径 | idi | 异戊烯基二磷酸异构酶 | 催化 | 内源基因，过表达以促进IPP与DMAPP相互转化 |
| Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 | 蒎烯生物合成途径 | PS (Pt1, 来自Pinus taeda，AF543527) | 蒎烯合成酶 | 催化 | 异源表达，催化GPP环化生成α-蒎烯和β-蒎烯 |
| Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 | 蒎烯生物合成途径 | PS (AG 3.18, 来自Abies grandis，U87909) | 蒎烯合成酶 | 催化 | 异源表达，产生等比例的α-和β-蒎烯 |
| Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 | 蒎烯生物合成途径 | GPPS1 (来自Abies grandis，AF513111) | 香叶基二磷酸合成酶 | 催化 | 异源表达，催化IPP和DMAPP缩合生成GPP |
| Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 | 蒎烯生物合成途径 | GPPS2 (来自Abies grandis，AF513112) | 香叶基二磷酸合成酶 | 催化 | 异源表达，与GPPS1相比酶活性不同 |
关键发现
- 共表达DXS和IDI与来自火炬松的PS和来自北美冷杉的GPPS1时，α-蒎烯产量达27±7 μg/g细胞干重
- 菌株Cg-pDI/pPPG2和Cg-pDI/pPPG1在48 h分别产生26.9±7和20.4±7.3 μg α-蒎烯/g CDW。添加0.25%、0.5%、1% (v/v)蒎烯使C. glutamicum生长速率降至不加蒎烯时的20%（最大比生长速率为0.26±0.01 h⁻¹），而添加20% (v/v)十二烷覆盖层后生长正常。α-蒎烯检出限为7 μg/L，定量限为35 μg/L
- β-蒎烯检出限为8.2 μg/L，定量限为41 μg/L。
研究结论
通过代谢工程在C. glutamicum中成功实现从葡萄糖合成蒎烯，这是该菌种中的首次报道。虽然产量较低，但两相原位萃取系统有效缓解了蒎烯毒性。进一步通过蛋白工程改造PS和GPPS，以及优化中央代谢通路，有望提高蒎烯产量。