Characterization of alcohol dehydrogenase from Kangiella koreensis and its application to production of all-trans-retinol
- 作者
- Seung-Hye Hong, Ho-Phuong-Thuy Ngo, Lin-Woo Kang, Deok-Kun Oh
- 单位
- Department of Bioscience and Biotechnology, Konkuk University, 1 Hwayang-dong, Gwangjin-gu, Seoul 143-701, Republic of Korea; Department of Biological Science, Konkuk University, 1 Hwayang-dong, Gwangjin-g, Seoul 143-701, Republic of Korea
- 杂志
- Biotechnology Letters（2014）
- DOI
- 10.1007/s10529-014-1740-x
- 所属领域
- 酶工程
- 关键词
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解决的核心问题
化学合成维甲类化合物存在纯化步骤复杂、产生化学废弃物和副产物等缺点，需要开发生物技术方法生产全反式视黄醇。本文旨在表征来自Kangiella koreensis的酒精脱氢酶（ADH）并用于全反式视黄醇的生物法生产。
研究策略
克隆并表达K. koreensis的ADH基因，纯化重组酶，表征其底物特异性和动力学参数，优化由全反式视黄醛还原为全反式视黄醇的反应条件（pH、温度、底物和酶浓度），并在优化条件下进行时间进程反应。
核心内容
本研究从海洋细菌Kangiella koreensis中克隆并表达了酒精脱氢酶（ADH）基因，在Escherichia coli ER2566中实现重组表达并纯化了带His标签的酶蛋白。对重组酶的酶学性质进行了系统表征，发现该酶以40 kDa二聚体形式存在，对全反式视黄醛的比活为21.3 nmol min⁻¹ mg⁻¹，Km为1.8 μM，kcat为1.7 min⁻¹，最适pH 6.5，最适温度60 °C，且不依赖金属离子、不受EDTA影响。氨基酸序列与多种动物ADH具有48.9%–70.5%的一致性，显示较高同源性。在优化反应条件（2,200 mg/L全反式视黄醛、2 g/L酶、5%甲醇、1%氢醌、10 mM NADH）下，3小时内可生产600 mg/L全反式视黄醇，转化率为27.3%（w/w），生产力达200 mg L⁻¹ h⁻¹。该研究首次报道了细菌ADH对全反式视黄醛的酶学特性，并证明其可用于全反式视黄醇的生物技术生产，为后续与β-胡萝卜素单加氧酶组合、实现从β-胡萝卜素或甘油到视黄醇的全生物合成奠定了基础。
创新点
首次对细菌ADH针对全反式视黄醛的酶学性质进行表征；首次利用ADH实现全反式视黄醇的生物技术生产；发现K. koreensis ADH与动物ADH有较高序列同源性（49-79%）。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Kangiella koreensis SW-125 | 视黄醇代谢 | ADH基因（GenBank登陆号ACV27458.1） | 酒精脱氢酶（ADH） | 催化 | 基因来源菌株，催化全反式视黄醛还原为全反式视黄醇，以NADH为辅因子。 |
| Escherichia coli ER2566 | 重组蛋白表达 | 重组ADH基因 | 重组ADH（带His标签） | 催化 | 用于酶表征和全反式视黄醇生产，优化条件下产量为600 mg/L。 |
关键发现
重组K. koreensis ADH以40 kDa二聚体形式存在，对全反式视黄醛的比活为21.3 nmol min⁻¹ mg⁻¹，Km为1.8 μM，kcat为1.7 min⁻¹，kcat/Km为0.95 μM⁻¹ min⁻¹。最适pH 6.5，最适温度60 °C。在优化条件下（2,200 mg all-trans-retinal/L，2 g酶/L，5%甲醇，1%氢醌，10 mM NADH），3 h内产生600 mg all-trans-retinol/L，转化率27.3% (w/w)，生产力200 mg L⁻¹ h⁻¹。酶不依赖金属离子，不受EDTA影响。氨基酸序列与鱼、大鼠、小鼠、马和蛙的ADH一致性分别为70.5%、53.5%、51.1%、53.5%和48.9%。
研究结论
K. koreensis ADH是首个用于全反式视黄醇生物技术生产的细菌ADH，可进一步与β-胡萝卜素单加氧酶（Blh）或工程菌组合，实现从β-胡萝卜素或甘油生物合成全反式视黄醇。