Metabolic engineering of Bacillus subtilis to enhance the production of tetramethylpyrazine

作者: Wu Meng, Ruiming Wang, Dongguang Xiao
单位: 天津科技大学工业发酵微生物省部共建教育部重点实验室; 齐鲁工业大学山东省微生物工程重点实验室
杂志: Biotechnology Letters（2015）
DOI: 10.1007/s10529-015-1950-x
所属领域: 代谢工程
关键词: 2,3-Butanediol2,3-Butanediol dehydrogenaseAcetoinBacillus subtilisMetabolic engineeringTetramethylpyrazine
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解决的核心问题

通过基因改造和发酵优化提高枯草芽孢杆菌发酵生产四甲基吡嗪（TTMP）的产量，尤其是通过阻断2,3-丁二醇（2,3-BD）的合成，使前体乙偶姻积累，并探索外源添加2,3-BD对TTMP产量的影响。

研究策略

敲除2,3-丁二醇脱氢酶基因（bdhA），阻断2,3-BD合成途径，使碳流向乙偶姻积累；同时在发酵培养基中外源添加不同浓度的2,3-BD（1-5 g/l），通过反馈调节进一步提高乙偶姻和TTMP的产量。

研究路线图

100%

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核心内容

为提升枯草芽孢杆菌发酵生产四甲基吡嗪（TTMP）的产量，该研究采用代谢工程策略，敲除了2,3-丁二醇脱氢酶基因（bdhA），阻断2,3-丁二醇（2,3-BD）合成途径，使碳流转向乙偶姻积累。结果显示，突变株BSA在微氧摇瓶发酵中TTMP产量达27.8 g/L，较原始菌株提高6 g/L，乙偶姻最大产量从11.3 g/L增至16.4 g/L，提高45%，而2,3-BD产量下降72.4%。进一步研究发现，外源添加2,3-BD可反馈促进产物合成，最适添加量为3 g/L时，TTMP产量从21.8 g/L提升至29.7 g/L，乙偶姻从11.3 g/L升至15.4 g/L，细胞密度也显著增加；但添加量超过4 g/L时产量转而下降。该研究首次通过基因改造枯草芽孢杆菌生产TTMP，并验证了外源添加2,3-BD作为一种低成本发酵调控手段的有效性，为TTMP工业化生产提供了可行思路，但2,3-BD促进合成的具体机制仍需深入探讨。

创新点

首次通过基因修饰改造枯草芽孢杆菌生产TTMP；敲除bdhA使TTMP和乙偶姻产量分别提高27.5%和45%；提出外源添加2,3-BD这一新颖、低成本的发酵调控方法，使TTMP和乙偶姻产量分别提高36.2%和36.3%。

研究对象（2）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
Bacillus subtilis BS2	乙偶姻/2,3-丁二醇代谢途径	bdhA	2,3-丁二醇脱氢酶	催化	敲除该基因以阻断2,3-BD合成，导致乙偶姻积累，TTMP产量提高
Bacillus subtilis BS2	乙偶姻/2,3-丁二醇代谢途径	—	—	调控	外源添加2,3-BD（1-5 g/l），最适添加量为3 g/l，通过反馈调节提高乙偶姻和TTMP产量

关键发现

敲除bdhA后得到突变株BSA，在微氧摇瓶发酵中TTMP产量达27.8 g/l，比原始菌株BS2高6 g/l
乙偶姻最大产量从11.3 g/l增加到16.4 g/l（提高45%），2,3-BD产量下降72.4%。外源添加2,3-BD实验中，当添加量从0增加到3 g/l时，BS2的TTMP产量从21.8 g/l提高到29.7 g/l，乙偶姻从11.3 g/l提高到15.4 g/l
添加量为4和5 g/l时产量反而下降（TTMP分别为25.7和18.7 g/l，乙偶姻为13.2和10.4 g/l）。最适添加量为3 g/l，此时细胞最大OD600为17.7（无添加时为12.2）。所有发酵中乙偶姻在144 h达到最大值，TTMP在168 h达到最大值。

研究结论

通过敲除bdhA阻断2,3-BD合成，使前体乙偶姻积累，能显著提高TTMP产量；外源添加2,3-BD是一种低成本且有效的提高TTMP和乙偶姻产量的方法。但2,3-BD促进合成的具体机制尚需进一步研究。