Production of Δ9- tetrahydrocannabinolic acid from cannabigerolic acid by whole cells of Pichia (Komagataella) pastoris expressing Δ9- tetrahydrocannabinolic acid synthase from Cannabis sativa L.
- 作者
- Bastian Zirpel, Felix Stehle, Oliver Kayser
- 单位
- Laboratory of Technical Biochemistry, Department of Biochemical & Chemical Engineering, TU Dortmund University, Emil-Figge-Str. 66, 44227 Dortmund, Germany
- 杂志
- Biotechnology Letters（2015）
- DOI
- 10.1007/s10529-015-1853-x
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
利用微生物全细胞生物技术生产Δ9-四氢大麻酚酸（THCA），以绕过底物CBGA水溶性低、THCAS在无细胞体系中难以应用的问题，并避免化学合成产率低和原料昂贵等缺陷。
研究策略
将大麻THCAS在大肠杆菌、酿酒酵母和毕赤酵母中进行异源表达，筛选最佳宿主（P. pastoris PP2_HC），通过液泡蛋白酶A信号肽将THCAS靶向液泡，优化培养温度和甲醇诱导条件，并采用全细胞生物转化将CBGA转化为THCA。
核心内容
本研究旨在通过微生物全细胞生物转化策略生产Δ9-四氢大麻酚酸（THCA），以克服底物CBGA水溶性低和游离酶催化不稳定的瓶颈。作者将大麻来源的THCAS分别在大肠杆菌、酿酒酵母和毕赤酵母中异源表达，筛选出毕赤酵母P. pastoris PP2_HC为最优宿主，并利用液泡蛋白酶A信号肽将THCAS靶向至液泡以提高酶稳定性。通过优化培养温度与甲醇诱导条件，15°C培养192 h获得最高胞内酶活98 pkat/ml，较文献报道提高6350%。在全细胞转化实验中，10.5 gCDW/L细胞在37°C和52°C下最大活性分别为328和601 pkat/gCDW，在重复添加1 mM CBGA条件下最终积累1 mM THCA（0.36 g/L），产量较裂解液反应提高400%，较早期报道提高900%。结果表明，毕赤酵母全细胞体系具备高效合成药用级THCA的能力，为THC类大麻素的工业化生物制造提供了可行的替代路线。
创新点
首次在毕赤酵母中实现THCAS的高水平功能表达，通过信号肽靶向液泡提高酶稳定性；利用全细胞生物转化策略克服底物水溶性限制；优化后THCAS酶活较文献报道提高6350%。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris (PichiaPink strain 2 Δpep4) | Δ9-四氢大麻酚酸生物合成 | THCAS | Δ9-四氢大麻酚酸合酶 | 催化 | 最优表达宿主，催化CBGA氧化环化生成THCA，胞内最高酶活98 pkat/ml。 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C Δpep4 | Δ9-四氢大麻酚酸生物合成 | THCAS | Δ9-四氢大麻酚酸合酶 | 催化 | 功能表达THCAS，但酶活较低（1 pkat/ml），未作为主要生产宿主。 |
| Escherichia coli (SHuffle T7 Express 和 lysY) | Δ9-四氢大麻酚酸生物合成 | THCAS | Δ9-四氢大麻酚酸合酶 | 催化 | 未能获得功能表达，可能缺乏真核伴侣蛋白或糖基化修饰。 |
| Pichia pastoris (PichiaPink strain 2 Δpep4) | Δ9-四氢大麻酚酸生物合成 | PEP4 | Proteinase A（液泡蛋白酶A） | 调控 | 敲除PEP4基因减少THCAS降解，提高异源蛋白积累。 |
| Pichia pastoris (PichiaPink strain 2 Δpep4) | Δ9-四氢大麻酚酸生物合成 | THCAS（含N端信号肽编码序列） | Proteinase A信号肽（24 aa） | 区室化 | 引导THCAS靶向液泡，实现胞内定位表达。 |
关键发现
- 在P. pastoris PP2_HC中，15°C培养192 h获得最高胞内THCAS活性98 pkat/ml，胞外活性44 pkat/ml
- 10°C时分别为54和43 pkat/ml，20°C为41和25 pkat/ml，25°C为14和7.6 pkat/ml。全细胞生物转化实验中，10.5 gCDW/L细胞在37°C和52°C下最大活性分别为328±6和601±32 pkat/gCDW
- 在重复添加1 mM CBGA的条件下，最终产生1 mM THCA（0.36 g THCA/L）。THCA产量比裂解液反应提高400%，比Taura等报道提高900%。
研究结论
毕赤酵母全细胞具备生产药用级THCA的能力，可作为未来工业化生物合成THC/THCA的替代方案。