Purification and characterization of a novel \(\beta\) -carotene- \(9^{\prime},10^{\prime}\) -oxygenase from Saccharomyces cerevisiae ULI3
- 作者
- Tao Wei, Beilei Jia, Shen Huang, Kunpeng Yang, Chunxiao Jia, Duobin Mao
- 杂志
- Biotechnology Letters（2015）
- DOI
- 10.1007/s10529-015-1872-7
- 所属领域
- 酶工程
- 关键词
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解决的核心问题
从微生物中分离纯化能够不对称切割β-胡萝卜素C9–C10双键并生成β-apo-10'-类胡萝卜素的酶，此前尚无微生物来源的BCO2酶被报道。
研究策略
从新鲜烟叶中分离酿酒酵母ULI3菌株，经硫酸铵沉淀、Q Sepharose和Superdex-200层析纯化β-胡萝卜素-9',10'-加氧酶（ScBCO2），并通过SDS-PAGE、MALDI-TOF-MS、HPLC/LC-MS进行鉴定，进一步研究温度、pH、金属离子、有机溶剂及底物动力学。
核心内容
本研究从新鲜烟叶中分离到一株酿酒酵母ULI3，通过硫酸铵沉淀、Q Sepharose和Superdex-200层析，纯化出一种新型β-胡萝卜素-9',10'-加氧酶（ScBCO2），这也是首次从微生物来源获得并表征该类酶。经SDS-PAGE和MALDI-TOF-MS鉴定，该酶分子量约50 kDa，纯化倍数为9.5倍，比活力0.38 U/mg。酶学性质分析显示，其最适温度为45°C、最适pH为8，Mg²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Ca²⁺及DTT可不同程度提升活性，而Mn²⁺和Fe²⁺则产生抑制；在50%的甲苯、丙酮等有机溶剂中仍能保留70%以上活性。底物动力学结果表明，该酶对含两个β-紫罗酮环的β-胡萝卜素催化效率最高（kcat/Km=77 min⁻¹·mM⁻¹），对α-胡萝卜素和叶黄素效率递减。LC-MS确认产物为β-apo-10'-胡萝卜醛（m/z 377）和β-紫罗酮（m/z 193）。该酶可高效不对称切割C9–C10双键，生成独角金内酯前体及香气物质β-紫罗酮，为类胡萝卜素裂解产物的生物制备提供了新酶源。
创新点
首次从酵母（微生物）来源纯化并表征β-胡萝卜素-9',10'-加氧酶，证明其可将β-胡萝卜素转化为独角金内酯前体β-apo-10'-胡萝卜醛和β-紫罗酮。
研究对象（1）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae ULI3 | 类胡萝卜素裂解途径（β-胡萝卜素→β-apo-10'-胡萝卜醛） | — | ScBCO2 | 催化 | 从酿酒酵母ULI3中纯化得到的β-胡萝卜素-9',10'-加氧酶，催化β-胡萝卜素C9'-C10'双键不对称裂解，产生β-apo-10'-胡萝卜醛和β-紫罗酮。 |
关键发现
- ScBCO2经纯化后纯化倍数为9.5倍，回收率10.8%，比活力0.38 U/mg
- SDS-PAGE显示分子量约50 kDa。最适温度45°C，最适pH 8。Mg²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Ca²⁺（5 mM）分别提高活性14%、17%、23%、26%，DTT（5 mM）提高27%，Tween 20和Triton X-100分别提高3%和7%
- Mn²⁺和Fe²⁺分别抑制13%和37%。在50%（v/v）甲苯、丙酮、苯、DMF、DMSO中保留70%以上活性。底物动力学：β-胡萝卜素kcat/Km=77 min⁻¹·mM⁻¹，α-胡萝卜素=49 min⁻¹·mM⁻¹，叶黄素=10 min⁻¹·mM⁻¹
- 对含两个β-紫罗酮环的底物催化效率最高。LC-MS鉴定产物为β-apo-10'-胡萝卜醛（m/z 377）和β-紫罗酮（m/z 193）。
研究结论
ScBCO2是一种新型β-胡萝卜素-9',10'-加氧酶，可高效催化β-胡萝卜素生成β-apo-10'-胡萝卜醛，在生物技术应用中具有潜在价值，可用于制备独角金内酯前体及β-紫罗酮。