Putative carotenoid genes expressed under the regulation of Shine–Dalgarno regions in Escherichia coli for efficient lycopene production
- 作者
- Weiyue Jin, Xian Xu, Ling Jiang, Zhidong Zhang, Shuang Li, He Huang
- 单位
- State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering, College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, Nanjing Tech University; College of Food Science and Light Industry, Nanjing Tech University; Institute of Microbiology, Xinjiang Academy of Agricultural Sciences; School of Pharmaceutical Sciences, Nanjing Tech University
- 杂志
- Biotechnology Letters（2015）
- DOI
- 10.1007/s10529-015-1922-1
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
从新种Deinococcus wulumuqiensis R12中鉴定推定的类胡萝卜素合成基因，并通过优化Shine-Dalgarno（SD）区域和培养条件，提高大肠杆菌中番茄红素的产量。
研究策略
通过基因组挖掘获得crtE、crtB、crtI三个推定的番茄红素合成基因，构建多顺反子表达质粒；优化SD和间隔序列（AS）组合，并筛选最佳培养基，在无IPTG诱导下实现番茄红素的高产。
核心内容
本研究从新种Deinococcus wulumuqiensis R12中通过基因组挖掘获得三个推定类胡萝卜素合成基因crtE、crtB、crtI，构建多顺反子表达质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)，系统优化Shine-Dalgarno（SD）序列与间隔序列（AS）的组合方式，并筛选最佳培养基，在不添加IPTG诱导的条件下实现番茄红素的高效合成。结果显示，相同SD+AS组合更有利于番茄红素积累，重组菌EDW11在2×YT+G培养基、30°C培养40小时条件下，番茄红素产量达到88 mg/g DCW（780 mg/L），较未优化SD区域的对照菌株（49 mg/g DCW，417 mg/L）分别提高79%和87%，为当时重组微生物生产番茄红素的最高报道水平。研究还发现LB培养基中产量为74 mg/g DCW（670 mg/L），而SM培养基仅为15 mg/g DCW（80 mg/L），说明培养基营养组成显著影响产物积累；增加IPTG浓度（0.2–1 mM）反而导致生物量和番茄红素产量下降。该工作为利用新物种基因资源和大肠杆菌中SD序列工程优化异源类异戊二烯途径提供了有效策略。
创新点
首次从新种Deinococcus wulumuqiensis R12中克隆并表达了番茄红素合成基因；系统优化了SD+AS序列组合，发现相同SD+AS组合更有利于番茄红素积累；在无IPTG诱导条件下获得目前重组大肠杆菌报道的最高番茄红素产量。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 番茄红素生物合成途径（MEP途径延伸） | crtE | geranylgeranyl diphosphate synthase | 催化 | 来自Deinococcus wulumuqiensis R12的推定性基因orf01490，催化FPP生成GGPP |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 番茄红素生物合成途径（MEP途径延伸） | crtB | phytoene synthase | 催化 | 来自Deinococcus wulumuqiensis R12的推定性基因orf00123，催化两分子GGPP缩合生成八氢番茄红素 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 番茄红素生物合成途径（MEP途径延伸） | crtI | phytoene desaturase | 催化 | 来自Deinococcus wulumuqiensis R12的推定性基因orf00124，催化八氢番茄红素脱氢生成番茄红素 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | — | — | — | 调控 | 优化SD+AS序列组合（SD+AS I和SD+AS II），影响crtB和crtI的翻译水平，不同组合对细胞生长和番茄红素产量有显著影响 |
关键发现
- 重组菌EDW11在2×YT+G培养基中、30°C、40h、无IPTG诱导条件下，番茄红素产量达到88 mg/g DCW（780 mg/L），较未优化SD区域的EDW菌株（49 mg/g DCW，417 mg/L）分别提高79%和87%
- 在LB培养基中EDW11产量为74 mg/g DCW（670 mg/L），SM培养基中仅为15 mg/g DCW（80 mg/L）
- 不同SD+AS组合中，EDW11产量最高（70 mg/g DCW, 690 mg/L），EDW21最低（29 mg/g DCW, 252 mg/L）
- 增加IPTG浓度（0.2–1 mM）导致生物量和番茄红素产量下降。
研究结论
通过优化SD+AS序列组合和培养基，重组大肠杆菌EDW11在不经IPTG诱导的条件下，番茄红素产量达到88 mg/g DCW（780 mg/L），是目前微生物生产番茄红素的最高水平。