Heterologous biosynthesis of triterpenoid dammarenediol-II in engineered Escherichia coli
- 作者
- Dashuai Li, Qiang Zhang, Zhijiang Zhou, Fanglong Zhao, Wenyu Lu
- 单位
- Key Laboratory of System Bioengineering (Tianjin University), Ministry of Education; SynBio Research Platform, Collaborative Innovation Center of Chemical Science and Engineering (Tianjin)
- 杂志
- Biotechnology Letters（2016）
- DOI
- 10.1007/s10529-015-2032-9
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在大肠杆菌中重建达玛烯二醇-II（dammarenediol-II）的异源生物合成途径，以获取达玛烷型四环人参皂苷的前体。
研究策略
采用合成生物学策略，在大肠杆菌中共表达来自酿酒酵母的角鲨烯合酶（SS）、来自酿酒酵母或甲基球菌的角鲨烯环氧化酶（SE）、来自拟南芥或酿酒酵母的NADPH-细胞色素P450还原酶（CPR），以及来自人参的达玛烯二醇-II合酶（DS），并通过共表达idi和ispA增强FPP前体供应，重建从IPP/DMAPP到达玛烯二醇-II的完整途径。
核心内容
该研究通过合成生物学策略，在大肠杆菌BL21(DE3)中异源重构了达玛烯二醇-II的完整生物合成途径，以期获得达玛烷型人参皂苷的关键前体。研究共表达了酿酒酵母角鲨烯合酶（ScERG9）、甲基球菌角鲨烯环氧化酶（McSE）、拟南芥或酿酒酵母来源的NADPH-细胞色素P450还原酶（CPR）以及人参达玛烯二醇-II合酶（DS），同时共表达idi和ispA以增强FPP前体供应。结果显示，McSE与两种CPR的匹配均能成功催化2,3-氧化鲨烯生成，而酿酒酵母SE的截短形式则无法实现该步骤。在最优条件（25°C、pH 7.5、0.5 mM IPTG）下，两个工程菌株DS1和DS2分别产到达玛烯二醇-II 8.63 mg/L和6.47 mg/L，且25°C诱导的产量约为37°C时的2倍。该研究首次在大肠杆菌中实现了达玛烯二醇-II的异源合成，鉴定了两种新的CPR可作为角鲨烯环氧化酶的还原伴侣，并建立了两个通用底盘菌株，为其他三萜类化合物在大肠杆菌中的异源生产提供了可行平台。
创新点
['首次在大肠杆菌中实现2,3-氧化鲨烯和达玛烯二醇-II的异源生物合成。', '鉴定出两种新的可作为角鲨烯环氧化酶还原酶伴侣的CPR（拟南芥tAtCPR和酿酒酵母tScCPR），它们能与甲基球菌来源的McSE匹配并催化电子转移。', '建立了两个能生产达玛烯二醇-II的大肠杆菌底盘菌株DS1和DS2，可进一步用于其他三萜类化合物的生产。']
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 三萜生物合成途径（异源） | ScERG9 (SS) | 角鲨烯合酶（酿酒酵母） | 催化 | 截短N端26个氨基酸，催化FPP生成角鲨烯 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 三萜生物合成途径（异源） | idi | 异戊烯基二磷酸异构酶（大肠杆菌） | 催化 | 催化IPP与DMAPP相互转化，增强前体供应 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 三萜生物合成途径（异源） | ispA | 法尼基二磷酸合酶（大肠杆菌） | 催化 | 催化IPP和DMAPP合成FPP，增强前体供应 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 三萜生物合成途径（异源） | t1ScERG1 | 角鲨烯环氧化酶（酿酒酵母，截短形式1） | 催化 | 截短N端28个氨基酸，实验未能与CPR匹配产生2,3-氧化鲨烯 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 三萜生物合成途径（异源） | t2ScERG1 | 角鲨烯环氧化酶（酿酒酵母，截短形式2） | 催化 | 截短N端55个氨基酸，实验未能与CPR匹配产生2,3-氧化鲨烯 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 三萜生物合成途径（异源） | McSE | 角鲨烯环氧化酶（甲基球菌） | 催化 | 密码子优化合成，与tAtCPR或tScCPR配合可产生2,3-氧化鲨烯 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 三萜生物合成途径（异源） | tAtCPR | NADPH-细胞色素P450还原酶（拟南芥） | 催化 | 截短N端45个氨基酸，作为McSE的还原伴侣，参与电子传递 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 三萜生物合成途径（异源） | tScCPR | NADPH-细胞色素P450还原酶（酿酒酵母） | 催化 | 截短N端33个氨基酸，作为McSE的还原伴侣，参与电子传递 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 三萜生物合成途径（异源） | DS | 达玛烯二醇-II合酶（人参） | 催化 | 密码子优化合成，催化2,3-氧化鲨烯环化生成达玛烯二醇-II |
关键发现
- 通过共表达截短N端26个氨基酸的酿酒酵母角鲨烯合酶（ScERG9）、甲基球菌角鲨烯环氧化酶（McSE）以及拟南芥或酿酒酵母的CPR，成功在大肠杆菌OSQ8和OSQ9菌株中检测到2,3-氧化鲨烯，而酿酒酵母SE的两种截短形式t1ScERG1和t2ScERG1与CPR组合均未产生2,3-氧化鲨烯。进一步导入人参达玛烯二醇-II合酶（DS）后，菌株DS1（含tAtCPR+McSE）和DS2（含tScCPR+McSE）均能产生达玛烯二醇-II。在最优条件下（25°C、pH 7.5、0.5 mM IPTG），DS1产量达8.63 mg/L，DS2达6.47 mg/L
- 25°C诱导时的产量约为37°C时的2倍。发酵上清液中未检测到达玛烯二醇-II、2,3-氧化鲨烯或角鲨烯。
研究结论
建立了两个大肠杆菌底盘菌株用于生产三萜类前体达玛烯二醇-II，该策略在引入不同氧化鲨烯环化酶（OSCs）后有望应用于其他三萜类化合物在大肠杆菌中的异源生产。