Functional characterization of ent-copaly digestion synthase from Andrographis paniculata with putative involvement in andrographolides biosynthesis
- 作者
- Qinqin Shen, Lixia Li, Yu Jiang, Qiang Wang
- 单位
- College of Agronomy, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China; College of Veterinary Medicine, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China; Institute of Ecological Agriculture, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China
- 杂志
- Biotechnology Letters（2015）
- DOI
- 10.1007/s10529-015-1961-7
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
表征穿心莲（Andrographis paniculata）中参与穿心莲内酯生物合成的ent-copalyl二磷酸合酶（ent-CPS）的功能，以阐明穿心莲内酯生物合成途径的起始步骤。
研究策略
从穿心莲中克隆ent-CPS基因（ApCPS），在大肠杆菌中异源表达全长和去除预测质体转运肽（27个氨基酸）的截短形式，与GGPP合酶共表达产生环化产物；利用水稻ent-CPP特异性kaurene合酶（OsKS）和小麦syn/normal-CPP反应性萜烯合酶（TaKSL1）共表达鉴定产物立体化学；通过定点突变验证DXDD基序关键天冬氨酸残基（D388）的功能；采用半定量RT-PCR和qRT-PCR分析基因表达模式，结合TLC分析组织中和MeJA诱导下的穿心莲内酯积累。
核心内容
该研究从穿心莲中克隆了ent-copalyl二磷酸合酶基因ApCPS，并在大肠杆菌中异源表达其全长及去除预测质体转运肽的截短形式（ApCPS d27）。通过与GGPP合酶共表达，两种形式均产生与ent-copalol标准品保留时间（19.16 min）和质谱一致的环化产物；进一步与水稻ent-CPP特异性kaurene合酶共表达生成ent-kaurene（保留时间17.79 min），证实产物立体构型为ent-CPP，而与小麦syn/normal-CPP反应性萜烯合酶共表达无萜类产物，排除了其他异构体。定点突变验证了DXDD基序中第一个天冬氨酸残基（D388）对酶活性的必要性，D388A突变导致活性完全丧失。表达分析显示ApCPS在穿心莲各组织均有表达，与穿心莲内酯积累的时空分布一致，且25 μM MeJA处理12小时内表达被强烈诱导，与内酯诱导积累相符合。这是穿心莲中首个被功能表征的ent-CPS，证实其催化GGPP环化生成ent-CPP，并参与穿心莲内酯生物合成的起始步骤，为该高价值药用二萜的合成途径解析和异源重构奠定了基础。
创新点
首次在穿心莲中表征了ent-CPS酶的功能，证明其催化GGPP形成ent-CPP；通过共表达OsKS和TaKSL1明确产物立体化学为ent-CPP；发现DXDD基序附近存在与次生代谢相关的Arg残基；基因表达模式与穿心莲内酯积累的时空分布及MeJA诱导响应一致，支持其参与穿心莲内酯生物合成。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 穿心莲内酯/二萜生物合成 | ApCPS | ApCPS | 催化 | 催化GGPP环化生成ent-CPP；全长和截短（缺失27个氨基酸转运肽）形式均在大肠杆菌中表达并具有活性 |
| Escherichia coli | 二萜前体供给 | GGPPS | GGPPS | 催化 | 来自巨冷杉（Abies grandis）的GGPP合酶，提供底物GGPP |
| Escherichia coli | ent-CPP立体化学鉴定 | OsKS | OsKS | 催化 | 水稻贝壳杉烯合酶，特异识别ent-CPP并催化生成ent-kaurene，用于验证产物立体构型 |
| Escherichia coli | syn/normal-CPP排除 | TaKSL1 | TaKSL1 | 催化 | 小麦萜烯合酶，可转化syn-和normal-CPP，共表达未检测到产物，排除这些异构体的产生 |
| Escherichia coli | 酶活性关键残基验证 | ApCPS(D388A) | ApCPS突变体 | 催化 | DXDD基序中第一个Asp突变为Ala，导致酶活性丧失，证明该残基对催化至关重要 |
| Andrographis paniculata | 穿心莲内酯生物合成 | ApCPS | ApCPS | 催化 | 基因表达分析显示在各组织（根、茎、叶、花、果荚、胚根、下胚轴）中均有表达，与穿心莲内酯积累相关；25 μM MeJA诱导12 h内表达显著上调 |
关键发现
- ApCPS全长和截短形式（ApCPS d27）与GGPP合酶在大肠杆菌中共表达，均产生与ent-copaloI标准品保留时间（RT=19.16 min）和质谱一致的产物
- ApCPS d27与OsKS共表达产生ent-kaurene（RT=17.79 min），证实产物为ent-CPP
- 与TaKSL1共表达未检测到萜类产物，表明ApCPS不产生syn-或normal-CPP
- 定点突变DXDD基序的第一个Asp（D388A）导致酶活性完全丧失。ApCPS在穿心莲的根、茎、叶、花、果荚、胚根和下胚轴中均有表达，与穿心莲内酯在这些组织中的积累对应（根和胚轴中积累量低，表达也低）
- 25 μM MeJA处理12 h内ApCPS表达被强烈诱导，与MeJA诱导的穿心莲内酯积累一致。
研究结论
ApCPS是从穿心莲中表征的第一个ent-CPS，催化GGPP环化生成ent-CPP，其基因表达模式与穿心莲内酯的组成型和诱导型积累相符合，表明ApCPS参与穿心莲内酯的生物合成，为具有高药用价值的穿心莲内酯生物合成途径研究奠定了基础。