Glutathione reductase from Brassica rapa affects tolerance and the redox state but not fermentation ability in response to oxidative stress in genetically modified Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- Ho-Sung Yoon, Sun-Young Shin, Young-Saeng Kim, Il-Sup Kim
- 杂志
- World Journal of Microbiology and Biotechnology（2012）
- DOI
- 10.1007/s11274-011-0988-8
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
外源表达植物来源的谷胱甘肽还原酶（BrGR）能否减轻酿酒酵母在氧化胁迫（如H2O2）下的有害效应，并增强其胁迫耐受性。
研究策略
将Brassica rapa subsp. pekinensis的谷胱甘肽还原酶基因（BrGR）克隆到酵母表达载体pVTU260中，构建转基因酿酒酵母；通过生长曲线、斑点试验、谷胱甘肽含量测定、2-DE/MALDI-TOF MS蛋白组学和免疫印迹等方法评估其表型、氧化还原状态和发酵能力。
核心内容
该研究在酿酒酵母BY4741中异源表达了来自大白菜的谷胱甘肽还原酶基因BrGR，以探究植物来源的该酶能否提升酵母在氧化胁迫下的耐受性。结果显示，转基因酵母的总谷胱甘肽还原酶活性比野生型高2倍；在30 mM H2O2处理1小时后，转基因株系的谷胱甘肽（GSH）含量达296.27 nmol/10^9 cells，明显高于野生型的228.32，氧化型谷胱甘肽（GSSG）则更低，使GSH/GSSG比值显著提升，同时细胞内氢过氧化物水平降低约1.4倍。转基因酵母对H2O2、甲萘醌、叔丁基过氧化氢、SDS、多种金属离子、NaCl、乙醇及热休克等胁迫的耐受性均增强，蛋白质羰基化水平更低。蛋白组学分析提示BrGR表达协同激活了糖酵解、磷酸戊糖途径、硫氧还蛋白系统及分子伴侣等多类救援蛋白，改善了细胞的氧化还原稳态和蛋白质稳态。然而，在20%葡萄糖高糖发酵条件下，转基因株系与野生型的酒精产量和残糖量无显著差异，表明外源BrGR可增强氧化胁迫耐受性但不提升发酵能力，该策略有望用于改善工业发酵中的胁迫抗性。
创新点
首次在酿酒酵母中异源表达植物谷胱甘肽还原酶BrGR，并证明其通过协同激活代谢酶、抗氧化系统和分子伴侣等多种细胞救援蛋白，改善氧化还原稳态和蛋白质稳态，从而增强对多种氧化胁迫的耐受性；且不影响高糖条件下的发酵能力。
研究对象（11）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 谷胱甘肽代谢 | BrGR | BrGR (glutathione reductase) | 催化 | 异源表达，催化GSSG还原为GSH |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 糖酵解 | HXK1 | Hxt (hexokinase) | 能量供给 | 己糖激酶，参与葡萄糖磷酸化，提供代谢能量 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 磷酸戊糖途径 | ZWF1 | G6PDH (glucose-6-phosphate dehydrogenase) | 能量供给 | 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，产生NADPH，为GR提供还原力 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 糖酵解 | TDH1/2/3 | GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) | 能量供给 | 甘油醛-3-磷酸脱氢酶，糖酵解关键酶，产生ATP和NADH |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 乙醛代谢 | ALD2/3/4/5/6 | Ald (aldehyde dehydrogenase) | 催化 | 乙醛脱氢酶，参与乙醇代谢 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 抗氧化系统 | GPX1/2 | Gpx (glutathione peroxidase) | 催化 | 谷胱甘肽过氧化物酶，清除过氧化物 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 硫氧还蛋白系统 | TRX2, TRX3 | Trx2, Trx3 | 催化 | 硫氧还蛋白，参与二硫键还原 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 硫氧还蛋白系统 | TRR1 | Trr1 (thioredoxin reductase) | 催化 | 硫氧还蛋白还原酶，还原Trx |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 抗氧化系统 | TSA1 | Tsa1 (thioredoxin peroxidase) | 催化 | 过氧化物氧化还原酶，清除H2O2 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 线粒体转运 | POR1 | Porin (VDAC) | 转运 | 线粒体外膜电压依赖性阴离子通道，释放ROS |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 分子伴侣网络 | HSP104, HSP90, HSP70, HSP42, HSP26, GRP, STI1, ZPR1 | Hsp104, Hsp90, Hsp70, Hsp42, Hsp26, Grp, Sti1, Zpr1 | 调控 | 分子伴侣及辅助因子，维护蛋白质稳态 |
关键发现
- 转基因酵母（TG）的总GR活性比野生型（WT）高2倍
- 在30 mM H2O2处理1 h后，TG细胞中总谷胱甘肽(tGSH)为303.96 nmol/10^9 cells（WT为237.16），GSSG为3.84 nmol/10^9 cells（WT为4.41），GSH为296.27 nmol/10^9 cells（WT为228.32），GSH/GSSG比值显著高于WT
- TG细胞中氢过氧化物水平比WT低约1.4倍
- TG细胞对H2O2、menadione、t-BOOH、SDS、CdCl2、ZnCl2、CuSO4、NaCl、乙醇和热休克等胁迫的耐受性增强
- 蛋白羰基化水平在WT中更高
- 但高糖（20%葡萄糖）条件下的酒精产量和残糖量与WT无显著差异。
研究结论
外源BrGR表达通过提高GSH再生和协同激活多种细胞救援蛋白，改善酵母的氧化还原稳态和蛋白质稳态，从而增强对ROS诱导氧化胁迫的获得性耐受性，但不提高高糖条件下的发酵能力。该策略可能为改善酵母发酵过程中的胁迫耐受性提供线索。