Alteration of flower colour in Ipomoea nil through CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis of carotenoid cleavage dioxygenase 4
- 作者
- Kenta Watanabe, Chihiro Oda-Yamamizo, Kimiyo Sage-Ono, Akemi Ohmiva, Michiyuki Ono
- 单位
- Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba; Institute of Vegetable and Floriculture Science, National Agriculture and Food Research Organization; Faculty of Life and Environmental Sciences, Gene Research Center, Tsukuba Plant Innovation Research Center (T-PIRC), University of Tsukuba
- 杂志
- Transgenic Research（2017）
- DOI
- 10.1007/s11248-017-0051-0
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
日本牵牛花（Ipomoea nil）的花瓣仅积累痕量类胡萝卜素，不产生黄色花，此前归因于类胡萝卜素合成基因表达极低，但仅提高合成基因表达未能改变花色，说明存在其他限制因素，本研究旨在解析类胡萝卜素裂解双加氧酶（CCD）是否参与花瓣中类胡萝卜素的降解调控。
研究策略
通过全基因组生物信息学鉴定I. nil的CCD基因家族，利用RT-qPCR分析表达模式，筛选出候选基因InCCD4；进一步通过CRISPR/Cas9系统对白色花品种AK77进行InCCD4靶向敲除，获得纯合突变体，通过HPLC分析花瓣及叶片中类胡萝卜素的含量与组成，并通过RT-qPCR比较类胡萝卜素合成及积累相关基因的表达。
核心内容
该研究针对日本牵牛花花瓣仅积累痕量类胡萝卜素、无法形成黄色花的现象，探究类胡萝卜素裂解双加氧酶是否参与花瓣中类胡萝卜素的降解调控。研究者通过全基因组鉴定牵牛花CCD基因家族，结合表达分析锁定候选基因InCCD4，并利用CRISPR/Cas9系统对白色花品种AK77进行靶向敲除，最终获得5个双等位纯合突变株系。突变体花瓣中脉呈现淡黄色，总类胡萝卜素含量较非转基因植株增加约20倍，主要成分为叶黄素、紫黄质和β-胡萝卜素且均以非酯化形式存在；而叶片中类胡萝卜素含量与组成与野生型无显著差异。进一步基因表达分析显示，突变体花瓣中类胡萝卜素合成相关基因（PSY、CHYB）及积累相关基因（Or、PYP1、CHRC）的表达水平与野生型一致，证实类胡萝卜素增加完全由InCCD4功能丧失所致。研究表明，花瓣中类胡萝卜素低积累是合成基因表达低与InCCD4降解共同作用的结果，InCCD4通过裂解反应负调控花瓣类胡萝卜素积累，而敲除该基因可有效改变花色，为类胡萝卜素代谢工程与花色改良提供了可行策略。
创新点
['首次在Ipomoea nil中通过CRISPR/Cas9实现类胡萝卜素裂解双加氧酶4（InCCD4）的完全敲除，成功将白色花瓣转变为淡黄色。', '证实I. nil花瓣中类胡萝卜素含量极低不仅由于合成基因表达低，还由于InCCD4介导的降解作用。', '揭示了仅含单个CCD4基因的植物中，非花瓣特异表达的CCD4也能调控花色。']
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Ipomoea nil cv. AK77 | 类胡萝卜素降解 | InCCD4 | CCD4 | 催化 | 类胡萝卜素裂解双加氧酶，负责裂解类胡萝卜素多烯链的特定双键，敲除后花瓣变淡黄色 |
| Ipomoea nil cv. AK77 | 类胡萝卜素生物合成 | PSY | 八氢番茄红素合酶 | 催化 | 类胡萝卜素合成限速酶，本文中表达水平无显著变化 |
| Ipomoea nil cv. AK77 | 类胡萝卜素生物合成 | CHYB | β-环羟化酶 | 催化 | 羟化酶，影响类胡萝卜素组成，表达水平无显著变化 |
| Ipomoea nil cv. AK77 | 类胡萝卜素积累调控 | Or | Orange蛋白 | 调控 | PSY的翻译后稳定因子，促进类胡萝卜素积累，表达无显著差异 |
| Ipomoea nil cv. AK77 | 类胡萝卜素积累调控 | PYP1 | PALE YELLOW PETAL 1 | 催化 | 类胡萝卜素酯酶，参与叶黄素酯化，表达无显著差异 |
| Ipomoea nil cv. AK77 | 类胡萝卜素积累调控 | CHRC | 色素体脂质相关蛋白 | 区室化 | 类胡萝卜素结合蛋白，参与色素质中的类胡萝卜素储存，表达无显著差异 |
| Ipomoea nil cv. AK77 | 基因组编辑 | Cas9 | Cas9核酸酶 | 催化 | CRISPR/Cas9系统实现InCCD4靶向敲除 |
关键发现
- 在Ipomoea nil cv. AK77中利用CRISPR/Cas9敲除InCCD4后，获得的5个双等位突变株系（ccd4）花瓣中脉呈现淡黄色，总类胡萝卜素含量较非转基因植株增加约20倍。HPLC分析表明，突变体花瓣中主要类胡萝卜素为叶黄素（lutein），另有紫黄质和β-胡萝卜素，且均为非酯化形式
- 叶片中类胡萝卜素含量和组成与野生型无显著差异。此外，突变体花瓣中类胡萝卜素合成相关基因（PSY、CHYB）及积累相关基因（Or、PYP1、CHRC）的表达水平与野生型无显著差异，表明类胡萝卜素增加仅由InCCD4功能丧失引起。
研究结论
InCCD4通过裂解类胡萝卜素负调控I. nil花瓣中类胡萝卜素的积累，低水平的类胡萝卜素是合成基因表达低与InCCD4降解共同作用的结果。利用CRISPR/Cas9敲除InCCD4可有效增加花瓣类胡萝卜素含量并改变花色，为类胡萝卜素代谢工程和花色改良提供了新策略。