Assessing the tobacco-rattle-virus-based vectors system as an efficient gene silencing technique in Datura stramonium (Solanaceae)
- 作者
- Mohammad Reza Eftekhariyan Ghamsari, Farah Karimi, Seyed Latif Mousavi Gargari, Seyed Ali Hosseini Tafreshi, Seyed Alireza Salami
- 单位
- National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology (NIGEB), Tehran, Iran; Department of Biology, Faculty of Basic Sciences, Shahed University, Tehran, Iran; Department of Biology, Faculty of Basic Sciences, Kashan University, Kashan, Iran; Department of Horticulture, Faculty of Agricultural science and engineering, Tehran University, Karaj, Iran
- DOI
- 10.1007/s11262-014-1104-6
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
曼陀罗托烷类生物碱天然产量有限，需要研究其生物合成途径中的基因，但缺乏高效的基因功能分析工具；本文评估TRV-VIGS体系在曼陀罗中沉默基因的可行性。
研究策略
利用烟草脆裂病毒（TRV）载体构建含曼陀罗pds基因片段（同源）和烟草pds基因片段（异源）的重组载体，通过农杆菌注射侵染曼陀罗幼苗，以pds为标志基因验证VIGS沉默效果，并通过白化表型、色素含量、基因表达及总生物碱含量进行分析。
研究路线图
核心内容
本研究以托烷类生物碱药用植物曼陀罗为对象，评估了基于烟草脆裂病毒的病毒诱导基因沉默（TRV-VIGS）体系在该植物中沉默目标基因的可行性与效率。研究者分别构建了含有曼陀罗同源pds片段和烟草异源pds片段的重组TRV载体，通过农杆菌注射侵染曼陀罗幼苗，以八氢番茄红素脱氢酶基因pds为标志基因验证沉默效果。实验结果显示，注射含同源Dspds片段的植株在两周后出现明显的光漂白表型，pds基因相对表达量下降约85%，总类胡萝卜素含量较对照降低超过76%，VIGS的有效率和频率分别达到75%和95%。同时，同源沉默导致的叶绿素a、b及类胡萝卜素下降程度均高于异源沉默，表明同源片段的沉默效率更优。该研究首次在曼陀罗中建立并验证了TRV-VIGS体系，证明其是一种可靠高效的基因功能分析工具，可用于托烷类生物碱生物合成途径相关基因的瞬时沉默与功能研究，为后续解析该重要药用植物活性成分的合成调控机制提供了技术支撑。
创新点
首次在曼陀罗中建立并验证TRV-VIGS基因沉默体系，证明同源沉默效率优于异源沉默，并提出该技术可用于托烷生物碱合成途径基因的功能研究。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 曼陀罗（Datura stramonium） | 类胡萝卜素生物合成 | pds (Dspds) | 八氢番茄红素脱氢酶 (Phytoene desaturase) | 催化 | 同源VIGS靶基因，沉默后产生白化表型，导致类胡萝卜素和叶绿素含量下降 |
| 本氏烟草（Nicotiana benthamiana） | 类胡萝卜素生物合成 | pds (Nbpds) | 八氢番茄红素脱氢酶 (Phytoene desaturase) | 催化 | 异源VIGS阳性对照，用于比较同源/异源沉默效率 |
关键发现
- 注射pTRV2-Dspds的曼陀罗植株2周后出现光漂白表型
- 总类胡萝卜素含量较对照降低超过76%
- pds基因相对表达量（pds/actin）降低约85%
- 空载体处理的植株总生物碱含量增加3.76倍
- VIGS有效率和频率分别为75%和95%
- 同源沉默（Dspds）导致叶绿素a、b和类胡萝卜素下降程度高于异源沉默（Nbpds）
- 曼陀罗pds与烟草pds核苷酸一致性为92%。
研究结论
TRV-based VIGS是一种有效、可靠的基因沉默工具，可用于曼陀罗的功能基因研究，尤其适用于托烷类生物碱生物合成途径相关基因的瞬时沉默研究。