高级醇 · 代谢工程文献库

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Design of a recombinant Escherichia coli for producing L-phenylalanine from glycerol

作者
Mayura Thongchuang, Piamsook Pongsawasdi, Yusuf Chisti, Kanoktip Packdibamrung
单位
Program in Biotechnology, Faculty of Science, Chulalongkorn University, Bangkok 10330, Thailand; Department of Biochemistry, Faculty of Science, Chulalongkorn University, Bangkok 10330, Thailand; School of Engineering, Massey University, Private Bag 11 222, Palmerston North, New Zealand
杂志
World Journal of Microbiology and Biotechnology（2012）
DOI
10.1007/s11274-012-1104-4
所属领域
代谢工程
关键词
Aromatic amino acid exporterBacillus lentusEscherichia coli BL21(DE3)Glycerol facilitatorL-PhenylalaninePhenylalanine dehydrogenase
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解决的核心问题

利用廉价甘油为碳源，通过重组大肠杆菌生产L-苯丙氨酸，解决底物甘油摄取不足和产物L-苯丙氨酸外排受限导致产量低的问题。

研究策略

在E. coli BL21(DE3)中表达来自Bacillus lentus的苯丙氨酸脱氢酶基因(phedh)，并共表达yddG（芳香族氨基酸输出蛋白）和glpF（甘油转运通道蛋白），构建重组质粒pPY和pPYF，通过摇瓶和发酵罐评估L-苯丙氨酸产量。

研究路线图

100%
研究问题：甘油为碳源产L-苯丙氨酸产量低
策略：共表达phedh + yddG + glpF基因
关键改造：构建pPY、pPYF双表达质粒
摇瓶验证：pPYF速率达2.9 mg/L·h
发酵罐放大：5 L罐产366 mg/L
结论：增强底物摄取与产物外排协同提产
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核心内容

该研究针对以甘油为碳源时大肠杆菌生产L-苯丙氨酸受底物摄取不足和产物外排受限的瓶颈，在E. coli BL21(DE3)中构建了重组共表达系统。作者将来源于Bacillus lentus的苯丙氨酸脱氢酶基因phedh与甘油转运蛋白基因glpF及芳香族氨基酸输出蛋白基因yddG共同克隆于pRSFDuet-1载体，各基因由独立T7lac启动子控制。摇瓶实验中，共表达pPY（PheDH+YddG）和pPYF（PheDH+YddG+GlpF）的菌株最大产酸速率分别达2.3和2.9 mg/L·h，较仅表达PheDH的对照提高1.4倍和1.8倍。在5 L发酵罐高供氧条件下（37°C，1 vvm，400 rpm），pPYF克隆诱导后56小时即达到最大浓度366 mg/L，较摇瓶最高值280 mg/L提高约1.3倍，且达到峰值时间由216小时缩短至56小时，生产率提升近5倍。结果表明，协同增强甘油摄取和产物外排可显著提升L-苯丙氨酸产量，高氧条件对加速产物积累具有重要作用。

创新点

首次将B. lentus的phedh基因与yddG（芳香族氨基酸外排蛋白）和glpF（甘油转运蛋白）共表达于同一载体pRSFDuet-1，各基因由独立T7lac启动子控制，以甘油为碳源，通过增强底物摄取和产物外排协同提高L-苯丙氨酸产量。

研究对象（3）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Escherichia coli BL21(DE3) L-苯丙氨酸生物合成途径 phedh PheDH 催化 来自Bacillus lentus（GenBank EU880599），催化苯丙酮酸还原胺化生成L-苯丙氨酸，分子量约41.3 kDa。
Escherichia coli BL21(DE3) L-苯丙氨酸生物合成途径 yddG YddG 转运 来自E. coli TOP10，编码芳香族氨基酸输出蛋白，促进L-苯丙氨酸外排，减轻反馈抑制。
Escherichia coli BL21(DE3) 甘油代谢途径 glpF GlpF 转运 来自E. coli TOP10，编码甘油转运通道蛋白，促进甘油跨膜摄取。

关键发现

  1. 在甘油培养基中，pPY和pPYF克隆的最大L-苯丙氨酸产生速率分别为2.3和2.9 mg/L·h，比pPheDH克隆（1.6 mg/L·h）提高1.4倍和1.8倍（P<0.0005）
  2. 在5 L搅拌罐中（37°C，1 vvm，400 rpm），pPYF克隆在诱导后56小时达到最大L-苯丙氨酸浓度366 mg/L，比摇瓶最高浓度280 mg/L高约1.3倍，且达到峰值时间由216小时缩短至56小时，生产率提高近5倍
  3. 摇瓶中各克隆最终L-苯丙氨酸浓度约250 mg/L（144小时）。

研究结论

通过共表达甘油转运蛋白GlpF和芳香族氨基酸输出蛋白YddG，可显著提高重组大肠杆菌以甘油为碳源生产L-苯丙氨酸的能力；高供氧的发酵罐条件可加快产物积累并提高最终浓度。