Molecular characterization and expression analysis of GIHMGS, a gene encoding hydroxymethylglutaryl-CoA synthase from Ganoderma lucidum (Ling-zhi) in ganoderic acid biosynthesis pathway
- 作者
- Ang Ren, Xiang Ouyang, Liang Shi, Ai-Liang Jiang, Da-Shuai Mu, Meng-Jiao Li, Qin Han, Ming-Wen Zhao
- 单位
- Microbiology Department, Key Laboratory for Microbiological Engineering of the Agricultural Environment, Ministry of Agriculture, College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Weigang No. 1, Nanjing 210095, Jiangsu, People's Republic of China
- 杂志
- World Journal of Microbiology and Biotechnology（2012）
- DOI
- 10.1007/s11274-012-1206-z
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
克隆并鉴定灵芝中参与灵芝酸生物合成的羟甲基戊二酰辅酶A合酶基因GIHMGS，研究其表达调控机制及对灵芝酸产量的影响。
研究策略
通过简并PCR和SEFA PCR克隆GIHMGS全长cDNA及启动子；利用酿酒酵母HMGS缺陷突变体进行功能互补验证；采用qRT-PCR分析信号分子、碳源和发育阶段对GIHMGS表达的影响；通过农杆菌介导转化过表达GIHMGS并测定灵芝酸含量。
核心内容
该研究首次从灵芝中克隆并鉴定了参与灵芝酸生物合成的羟甲基戊二酰辅酶A合酶基因GIHMGS。通过简并PCR和SEFA PCR获得全长cDNA（含1413 bp开放阅读框，编码471个氨基酸）及1561 bp启动子，并在酿酒酵母HMGS缺陷突变体中验证了其催化功能。表达分析表明，水杨酸、脱落酸和茉莉酸甲酯处理4小时后GIHMGS转录水平分别上调至对照的18.81、41.93和64.75倍；以麦芽糖为碳源时表达量约为蔗糖的7.25倍，且菌丝发育第16天表达峰值达第10天的2.98倍。农杆菌介导的过表达株OE7中GIHMGS转录水平为野生型的2.3倍，灵芝酸含量提高15.1%–24.2%，其中100 μM水杨酸处理使灵芝酸含量达2.74 mg/100mg干重，为对照的1.30倍。该研究证实GIHMGS是灵芝酸合成的关键限速酶，其表达受信号分子、碳源及发育阶段多层级调控，为通过代谢工程策略强化灵芝酸生产提供了分子靶点和调控依据。
创新点
['首次在真菌中克隆并表征HMGS基因', '鉴定了GIHMGS启动子中多个环境响应顺式元件', '证明SA、ABA、MeJA及碳源（麦芽糖）能诱导GIHMGS表达', '过表达GIHMGS显著提高灵芝酸含量']
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 酿酒酵母YSC1021（HMGS缺陷突变株） | 甲羟戊酸途径 | GIHMGS | 羟甲基戊二酰辅酶A合酶（HMGS） | 催化 | 功能互补验证GIHMGS编码功能性HMGS |
| 灵芝（Ganoderma lucidum） | 灵芝酸生物合成途径（甲羟戊酸途径） | GIHMGS | 羟甲基戊二酰辅酶A合酶（HMGS） | 催化 | 过表达GIHMGS使GA含量提高15.1%–24.2% |
关键发现
- GIHMGS全长cDNA含1413 bp开放阅读框，编码471个氨基酸
- 基因组DNA长1870 bp，含4个内含子
- 启动子长1561 bp。酵母功能互补验证GIHMGS具有HMGS活性。SA、ABA、MeJA处理4 h后GIHMGS表达分别上调至对照的18.81、41.93和64.75倍
- 100 μM SA处理使GA含量达2.74±0.25 mg/100mg DW，为对照（2.11±0.08）的1.30倍。以麦芽糖为碳源时GIHMGS表达量约为蔗糖的7.25倍。菌丝发育第16天表达量最高，为第10天的2.98倍。过表达株OE7中GIHMGS转录水平为野生型的2.3倍，GA含量比野生型提高15.1%–24.2%。
研究结论
首次从灵芝中克隆并表征了GIHMGS，证实其编码产物具有HMGS催化功能，参与灵芝酸生物合成；GIHMGS表达受信号分子、碳源和发育阶段调控，过表达GIHMGS可增强灵芝酸产量，为灵芝酸生物合成调控的分子机制研究提供了基础。