Heterologous expression of β-xylosidase gene from Paecilomyces thermophila in Pichia pastoris
- 作者
- Veeresh Juturu, Jin Chuan Wu
- 杂志
- World Journal of Microbiology and Biotechnology（2012）
- DOI
- 10.1007/s11274-012-1176-1
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解决嗜热真菌Paecilomyces thermophila的β-木糖苷酶因结构复杂而难以在异源宿主中功能性表达的问题，以实现该酶的分泌型过量生产。
研究策略
将P. thermophila的β-木糖苷酶基因（NCBI GU937001）合成后克隆到pPICZαA载体，置于AOX1启动子和α-因子信号肽下游，转化毕赤酵母KM71，通过zeocin筛选高表达转化子，摇瓶甲醇诱导分泌表达，纯化并表征酶学性质。
核心内容
针对嗜热真菌Paecilomyces thermophila的β-木糖苷酶因结构复杂难以在异源宿主中功能性表达的问题，本研究将该酶基因合成后克隆至pPICZαA载体，置于AOX1启动子和α-因子信号肽下游，转化毕赤酵母KM71，经zeocin筛选获得高拷贝转化子，并通过摇瓶甲醇诱导实现分泌表达。结果显示，重组酶分泌表达量为0.22 mg/L，SDS-PAGE测得分子量约52.3 kDa，为理论预测值（39.31 kDa）的1.3倍，推测源于非常规翻译后修饰。该酶最适温度60°C、最适pH 7，以p-硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷为底物时Km为8 mM，比活力0.26 U/mg，同时具有6.2 U/mg的阿拉伯呋喃糖苷酶活性，表现出双功能催化特性。在10%燕麦草木聚糖底物、60°C和pH 7条件下酶解24小时可产生4 g/L木糖。该研究首次在毕赤酵母中实现了该β-木糖苷酶的分泌型功能性表达，其兼具木糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶活性的特点，使其在工业半纤维素降解中具有潜在应用价值。
创新点
首次在毕赤酵母中分泌表达P. thermophila β-木糖苷酶；发现该酶同时具有β-木糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶双功能活性；重组蛋白分子量高于理论预测值，推测由非常规翻译后修饰引起。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris KM71 | 甲醇代谢 | AOX1 | 醇氧化酶1 | 调控 | AOX1启动子驱动异源β-木糖苷酶基因的甲醇诱导表达 |
| Pichia pastoris KM71 | 蛋白质分泌 | α-factor | α-交配因子信号肽 | 转运 | 引导β-木糖苷酶分泌至胞外培养基 |
| Escherichia coli TOP10 | 质粒扩增 | β-xylosidase gene (GU937001) | β-木糖苷酶 | 催化 | 用于克隆和质粒构建，不表达目标蛋白 |
| Paecilomyces thermophila J18 | 木聚糖降解 | β-xylosidase gene (GU937001) | β-木糖苷酶 | 催化 | 天然来源的嗜热真菌酶，在毕赤酵母中异源表达后兼具阿拉伯呋喃糖苷酶活性 |
关键发现
- 重组β-木糖苷酶在毕赤酵母中分泌表达量为0.22 mg/L
- SDS-PAGE测得分子量52.3 kDa，为预测值39.31 kDa的1.3倍
- 最适温度60°C，最适pH 7
- 以p-硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷为底物时Km为8 mM，Vmax为54 μmol min⁻¹ mg⁻¹，比活力0.26 U/mg
- 同时具有6.2 U/mg的阿拉伯呋喃糖苷酶活性
- 从燕麦草木聚糖（10% w/v）在60°C、pH 7下酶解24 h产生4 g/L木糖
- 1 g燕麦草可制备约0.4 g木聚糖
- 耐200 μg/mL zeocin的多拷贝转化子蛋白表达量最高。
研究结论
成功在毕赤酵母中分泌表达了P. thermophila的β-木糖苷酶，重组酶最适pH 7、最适温度60°C，兼具木糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶活性，分子量高于预测值可能源于非常规翻译后修饰，该酶在工业半纤维素降解中具有应用潜力。