Genome-Scale NAD(H+) Availability Patterns as a Differentiating Feature between Saccharomyces cerevisiae and Scheffersomyces stipitis in Relation to Fermentative Metabolism
- 作者
- Alejandro Acevedo, German Aroca, Raul Conejeros
- 单位
- Escuela de Ingeniería Bioquímica, Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, Valparaíso, Chile; Bioenercel S.A., Barrio Universitario, Concepción, Chile
- 杂志
- PLoS ONE（2014）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0087494
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
比较Saccharomyces cerevisiae与Scheffersomyces stipitis在NAD(H+)可利用性模式上的差异，解释Crabtree效应（溢流现象）存在与否的代谢网络特征。
研究策略
使用基因组规模约束性代谢模型（iMM904和iBB814），结合表型相平面分析、影子价格分析、通量可变性分析和反应删除优化，系统比较两种酵母在氧摄取受限条件下生长对还原能力可利用性的敏感性及代谢通量跨度。
核心内容
该研究基于基因组规模代谢模型，以NADH和NAD影子价格之差定义“可用还原能力”γredox，系统比较了酿酒酵母和树干毕赤酵母在氧摄取受限条件下发酵代谢的差异。表型相平面和通量可变性分析显示，酿酒酵母在所有氧受限表型中γredox均为正，即还原能力过量，且代谢通量跨度显著增加；而树干毕赤酵母仅部分表型还原能力过量，通量跨度基本不变。在葡萄糖摄取率为4.45 mmol gDW⁻¹ h⁻¹时，树干毕赤酵母预测最大比生长速率为0.429 h⁻¹，与实验值0.47 h⁻¹接近；酿酒酵母在高葡萄糖摄取率下则表现出乙醇生产。反应删除优化筛选出HEX1、PGCD和GLUD1三个单基因缺失，可使树干毕赤酵母复现酿酒酵母的γredox模式；COX单缺失的树干毕赤酵母在高通气条件下可产生乙醇，与文献一致。这些结果表明，还原能力过量与通量跨度增加是Crabtree效应溢流行为的网络特征，影子价格分析为理解酵母发酵代谢差异和代谢工程改造提供了直接关联的新视角。
创新点
提出以NADH和NAD影子价格之差定义'可用还原能力'（γredox），将代谢网络对还原能力的敏感性响应与发酵行为直接关联；识别出S. cerevisiae在所有氧受限表型中还原能力过量且通量跨度增加，而S. stipitis仅在部分表型过量且通量跨度不变；通过优化法找到使S. stipitis复现S. cerevisiae还原能力模式的单基因缺失（HEX1、PGCD、GLUD1）。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Scheffersomyces stipitis | 氧化磷酸化/呼吸链 | NDH1 | NADH dehydrogenase complex I | 能量供给 | S. stipitis特异的呼吸链复合体I，S. cerevisiae缺乏；与AOX双缺失模拟实验 |
| Scheffersomyces stipitis | 氧化磷酸化/呼吸链 | AOX | alternative oxidase | 能量供给 | 替代氧化酶，S. cerevisiae缺乏；在氧受限条件下被诱导，作为电子汇 |
| Scheffersomyces stipitis | 氧化磷酸化/呼吸链 | COX | cytochrome c oxidase | 能量供给 | 细胞色素c氧化酶；单缺失导致高通气条件下乙醇显著生成 |
| Scheffersomyces stipitis | 糖酵解 | HEX1 | hexokinase 1 | 催化 | 缺失后可在S. stipitis中复现S. cerevisiae的γredox模式；溢流现象中表达下调 |
| Scheffersomyces stipitis | 甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢 | PGCD | phosphoglycerate dehydrogenase | 催化 | 缺失后可复现S. cerevisiae的γredox模式；溢流时碳通量降低 |
| Scheffersomyces stipitis | 氮代谢/TCA旁路 | GLUD1 | glutamate dehydrogenase (NADH dependent) | 催化 | 缺失后可复现S. cerevisiae的γredox模式；催化TCA旁路的第一步反应 |
| Scheffersomyces stipitis | 氧化磷酸化 | ATPSm | mitochondrial ATP synthase | 能量供给 | 与AOX、GLUD1等三重缺失时生长与乙醇生产耦合 |
| Scheffersomyces stipitis | 氧化磷酸化 | CYOOm | cytochrome c oxidase, mitochondrial | 能量供给 | 与AOX、GLUD1等三重缺失时生长与乙醇生产耦合 |
| Scheffersomyces stipitis | 氧化磷酸化 | CYOR_u6m | ubiquinol-6 cytochrome c reductase | 能量供给 | 与AOX、GLUD1等三重缺失时生长与乙醇生产耦合 |
关键发现
- S. stipitis在葡萄糖摄取率4.45 mmol gDW^-1 h^-1下预测最大比生长速率为0.429 h^-1（实验值0.47 h^-1）
- S. cerevisiae在葡萄糖摄取率14.08 mmol gDW^-1 h^-1、氧摄取上限2.8 mmol gDW^-1 h^-1时，比生长速率0.40 h^-1、乙醇生产率19.90 mmol gDW^-1 h^-1。S. cerevisiae在所有氧摄取受限表型中γredox均为正（还原能力过量），S. stipitis仅在部分表型为正。通量可变性分析显示S. cerevisiae在氧受限下通量跨度显著增加，S. stipitis基本不变。优化筛选出HEX1、PGCD、GLUD1单缺失可使S. stipitis复制S. cerevisiae的γredox模式
- COX单缺失的S. stipitis在高通气下可产生乙醇，与文献一致。
研究结论
S. cerevisiae在氧摄取受限时表现出还原能力过量和代谢通量跨度增加，这与其溢流发酵行为相关；S. stipitis还原能力仅部分过量且通量跨度不变，与其呼吸型代谢一致。研究建立了代谢网络影子价格（可用还原能力）与发酵行为之间的直接关联，为理解Crabtree效应和酵母代谢工程提供了新视角。