Transcriptome Analysis of Medicinal Plant Salvia miltiorrhiza and Identification of Genes Related to Tanshinone Biosynthesis
- 作者
- Lei Yang, Guohui Ding, Haiyan Lin, Haining Cheng, Yu Kong, Yukun Wei, Xin Fang, Renyi Liu, Lingjian Wang, Xiaoya Chen, Changqing Yang
- 单位
- 中国科学院上海辰山植物科学研究中心/上海辰山植物园；中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所植物分子遗传国家重点实验室、国家植物基因研究中心；中国科学院上海生命科学研究院系统生物学重点实验室；中国科学院上海生命科学研究院上海植物逆境生物学研究中心
- 杂志
- PLoS ONE（2013）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0080464
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析药用植物丹参（Salvia miltiorrhiza）中丹参酮生物合成途径尚未完全阐明的步骤以及其根特异性积累的分子机制，鉴定参与丹参酮生物合成的关键酶和转录调控因子。
研究策略
利用454 GS-FLX高通量测序平台对丹参根和叶组织分别进行转录组测序，通过de novo组装获得unigenes；结合序列同源性比对与GO/KEGG功能注释，比较根和叶的转录组差异表达；基于已知丹参酮途径基因和根特异性表达模式，预测候选细胞色素P450、脱氢酶、还原酶及转录因子，并通过qRT-PCR和RACE验证。
核心内容
利用454 GS-FLX测序平台对丹参根和叶组织分别进行转录组测序，经de novo组装获得64,139条unigenes，是目前最大的丹参转录组数据集，其中约半数获得功能注释。通过比较根与叶的转录组差异，鉴定出2,863个根高表达和2,561个叶高表达unigenes，并系统分析了MEP/MVA途径及萜类合酶基因的组织表达特征。已知丹参酮合成关键基因SmCPS、SmKSL在根中特异性表达，CYP76AH1根中表达量为叶的3.7倍；三个SmGGPPS基因均呈根偏好表达，其中SmGGPPS3根中RPKM达1988.85，而叶中仅78.33。进一步筛选出63个根中表达上调超过2倍的P450候选基因，qRT-PCR验证21个中有20个与测序结果一致；预测的短链脱氢酶SmSD和双键还原酶SmDBR在根中表达分别为叶的15.5倍和2.3倍，可能参与丹参酮下游转化。此外，在735个转录因子中发现AP2/ERF家族根上调8个、GRAS家族根上调5个，提示其可能协同调控丹参酮合成与根发育。该研究为阐明丹参酮生物合成途径及其根特异性积累机制提供了重要的基因资源和候选靶点。
创新点
首次对丹参根和叶分别进行转录组比较分析，构建了目前最大的丹参unigene数据集（64,139条）；系统分析MEP/MVA途径基因的组织表达差异；发现SmGGPPS在根中显著高表达；鉴定出63个根中高表达的P450基因，并利用qRT-PCR验证了20/21的可靠性；预测了SmSD和SmDBR可能参与丹参酮下游转化；发现根上调的AP2/ERF和GRAS转录因子可能调控丹参酮合成与根发育。
研究对象（11）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 丹参（Salvia miltiorrhiza） | MEP途径 | SmDXS1、SmDXR、SmHDR2等 | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶、4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶 | 催化 | MEP途径基因在叶中表达较高，但SmDXS2在根中上调 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza） | MVA途径 | SmAACT1、SmHMGR、SmIPPI1等 | 乙酰辅酶A乙酰转移酶、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶、异戊烯基焦磷酸异构酶 | 催化 | MVA途径基因在根中较活跃表达 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza） | 萜类前体合成（二萜） | SmGGPPS1、SmGGPPS2、SmGGPPS3 | 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶 | 催化 | SmGGPPS在根中显著高表达，为丹参酮合成提供前体GGPP |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza） | 丹参酮生物合成 | SmCPS | 柯巴基焦磷酸合酶（copalyl diphosphate synthase） | 催化 | 根中特异性表达，催化GGPP转化为CPP |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza） | 丹参酮生物合成 | SmKSL | 贝壳杉烯合酶类似蛋白（kaurene synthase-like） | 催化 | 根中特异性表达，催化CPP转化为miltiradiene |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza） | 丹参酮生物合成 | CYP76AH1 | 细胞色素P450单加氧酶（CYP76AH1） | 催化 | 根中表达比叶高3.7倍，催化miltiradiene羟基化生成ferruginol |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza） | 丹参酮下游修饰 | SmSD | 短链脱氢酶（short-chain dehydrogenase） | 催化 | 与Zingiber zerumbet ZSD1有66%核苷酸一致性，根中表达为叶15.5倍 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza） | 丹参酮下游修饰 | SmDBR | 双键还原酶（double bond reductase） | 催化 | 与Artemisia annua DBR2有69%一致性，根中表达为叶2.3倍 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza） | 萜类合成 | TPSs | 单萜/倍半萜/二萜合酶 | 催化 | 鉴定出24个TPS unigenes，包括单萜合酶、倍半萜合酶、ent-kaurene合酶及鲨烯合酶 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza） | 丹参酮生物合成调控 | AP2/ERF转录因子（8个根中上调） | AP2/ERF类转录因子 | 调控 | 可能调控丹参酮合成基因表达，类似AaERF1/2调控青蒿素合成 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza） | 丹参酮生物合成调控 | GRAS转录因子（5个根中上调） | GRAS家族转录因子（SHR/SCR同源物） | 调控 | 与根皮层发育相关，可能间接影响丹参酮在根中的积累 |
关键发现
- 454测序产生根550,546条reads、叶525,292条reads，组装后获得64,139个unigenes（29,883 isotigs和34,256 singletons），平均长度413 bp，总长26.4 Mb。50%（32,096）unigenes获得功能注释
- KEGG分析确定168个萜类骨架生物合成相关unigenes（144个MEP/MVA途径基因、24个萜类合酶）。比较转录组发现2,863个根高表达和2,561个叶高表达unigenes。已知丹参酮途径基因SmCPS、SmKSL在根中特异性表达，CYP76AH1在根中表达量为叶的3.7倍。SmGGPPS1的RPKM在根为910.88、叶为258.41
- SmGGPPS2根9.51、叶0
- SmGGPPS3根1988.85、叶78.33。发现63个P450 unigenes在根中>2倍（FDR<0.05）上调，qRT-PCR验证21个中20个在根中高表达。预测的SmSD在根中表达为叶的15.5倍（FDR<0.01），SmDBR为2.3倍。735个转录因子中67个根上调、45个叶上调
- 其中AP2/ERF家族根上调8个、叶2个
- GRAS家族根5个、叶1个。
研究结论
本研究产生了丹参最大的unigene数据集，基于根偏好表达模式鉴定了参与丹参酮生物合成的候选酶（CYP450s、脱氢酶、还原酶）以及候选转录因子（AP2/ERF、GRAS等），为深入解析丹参酮生物合成途径及其调控机制、理解多年生植物根部次生代谢提供了重要资源。