Construction of Novel Saccharomyces cerevisiae Strains for Bioethanol Active Dry Yeast (ADY) Production
- 作者
- Daoqiong Zheng, Ke Zhang, Kehui Gao, Zewei Liu, Xing Zhang, Ou Li, Jianguo Sun, Xiaoyang Zhang, Fengguang Du, Peiyong Sun, Aimin Qu, Xuechang Wu
- 单位
- Institute of Microbiology, College of Life Sciences, Zhejiang University; State Key Laboratory of Motor Vehicle Biofuel Technology (Tianquan Group Co., Ltd.)
- 杂志
- PLoS ONE（2013）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0085022
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
构建适用于生物乙醇活性干酵母（ADY）生产的新型酿酒酵母菌株，克服工业菌株ZTW1干燥耐受性差的问题，同时保持并提高其乙醇发酵性能。
研究策略
采用改良的全基因组重排（WGS）技术：先用MBC诱导亲本ZTW1产生染色体变异，再通过三轮孢子形成与随机杂交实现基因组重排，结合干燥/复水筛选和多胁迫平板筛选，获得多重耐受性和乙醇产量提高的突变株Z3-86，并利用iTRAQ蛋白质组学、生理生化分析和RT-qPCR解析其改良机制。
核心内容
针对工业菌株ZTW1在生物乙醇活性干酵母生产中干燥耐受性不足的问题，本研究采用改良的全基因组重排技术构建新型酿酒酵母菌株。具体流程为：先用MBC诱导亲本染色体变异，再经三轮孢子形成与随机杂交实现基因组重排，结合干燥/复水及多胁迫平板筛选获得突变株Z3-86。该菌株在280 g/L葡萄糖、35°C胁迫条件下乙醇产量达127.41 g/L，较亲本提高4.4%；去除92%水分后存活率为67.1%，约为亲本21.3%的3倍。Z3-86对乙醇、渗透压、热和H2O2的存活率分别提升78.1%、38.5%、77.8%和81.1%，丙二醛含量降低28.0%，麦角固醇含量提高14.6%，渗透胁迫下海藻糖含量占干重13.5%并维持更高谷胱甘肽水平。iTRAQ蛋白质组学结合生理生化与RT-qPCR分析显示，表型改善源于蛋白代谢增强、质膜完整性提高、海藻糖积累增多及抗氧化能力增强。结果表明改良WGS能系统性重塑多重胁迫耐受性，Z3-86具备商业生物乙醇ADY菌株的应用潜力。
创新点
1. 首次将WGS技术应用于生物乙醇ADY菌株的构建；2. 发展了MBC诱变结合多轮孢子杂交的改良WGS流程；3. 系统揭示了WGS通过改变蛋白代谢、膜组成、海藻糖代谢和氧化应激响应来改善微生物复杂性状的机制。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae ZTW1 | 乙醇发酵/糖酵解 | ADH1, PFK2, TPI1 | 乙醇脱氢酶, 磷酸果糖激酶, 磷酸丙糖异构酶 | 催化 | 亲本工业菌株，乙醇产量较高但干燥耐受性差 |
| Saccharomyces cerevisiae Z3-86 | 乙醇发酵/糖酵解 | ADH1, PFK2, TPI1 | 乙醇脱氢酶, 磷酸果糖激酶, 磷酸丙糖异构酶 | 催化 | 经三轮WGS获得，乙醇产量比ZTW1提高4.4%（127.41 vs 122.08 g/L） |
| Saccharomyces cerevisiae Z3-86 | 海藻糖代谢 | TPS1, TPS2, TPS3, TSL1, NTH1, PGM1 | 海藻糖合酶复合体、海藻糖磷酸酶等 | 催化 | 海藻糖合成相关基因上调，渗透胁迫8 h时海藻糖含量达干重13.5%（ZTW1为10.8%） |
| Saccharomyces cerevisiae Z3-86 | 麦角固醇合成 | HMG1, ERG9 | HMG-CoA还原酶、法尼基二磷酸法尼基转移酶 | 催化 | 麦角固醇含量比ZTW1高14.6%，增强膜稳定性 |
| Saccharomyces cerevisiae Z3-86 | 谷胱甘肽/谷氧还蛋白系统 | GSH2, GLR1 | 谷胱甘肽合成酶、谷胱甘肽还原酶 | 催化 | GSH含量在正常和渗透胁迫下分别比ZTW1高38.2%和27.5% |
| Saccharomyces cerevisiae Z3-86 | 硫氧还蛋白系统 | TRX2 | 硫氧还蛋白2 | 调控 | iTRAQ显示上调表达，参与氧化应激响应 |
| Saccharomyces cerevisiae Z3-86 | 戊糖磷酸途径 | GRE3, SOL4, GND2 | 醛糖还原酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶等 | 催化 | 多个上调基因参与NADPH生成，为抗氧化系统提供还原力 |
关键发现
- 突变株Z3-86在胁迫条件下（280 g/L葡萄糖，35°C）乙醇产量为127.41 g/L，比亲本ZTW1（122.08 g/L）提高4.4%
- 干燥（去除92%水分）后存活率为67.1%，ZTW1为21.3%，提高约2.15倍（表2中为3.15倍，摘要表述为2.15倍）
- Z3-86对乙醇、渗透压、热和H2O2的存活率分别比ZTW1高78.1%、38.5%、77.8%和81.1%
- 其MDA含量比ZTW1低28.0%
- 麦角固醇含量高14.6%
- 在渗透胁迫8 h时海藻糖含量占干重13.5%（ZTW1为10.8%）
- 正常和渗透胁迫下GSH含量分别比ZTW1高38.2%和27.5%。
研究结论
改良WGS构建的突变株Z3-86在乙醇产量、干燥存活率及多重胁迫耐受性上均显著优于亲本ZTW1，具备作为商业生物乙醇ADY菌株的潜力。其表型改善与蛋白代谢增强、质膜完整性提高、海藻糖积累增多以及抗氧化能力增强有关。