Carotenoid Analysis in Mutants from Escherichia coli Transformed with Carotenogenic Gene Cluster and Scenedesmus obliquus Mutant C-6D
- 作者
- GERHARD SANDMANN
- 杂志
- Methods in Enzymology（1993）
- DOI
- 10.1016/0076-6879(93)14077-v
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
通过HPLC分析类胡萝卜素生物合成突变体中的中间产物，包括大肠杆菌转化子缺失突变体和Scenedesmus obliquus紫外突变体C-6D。
研究策略
利用部分酶切和定向克隆构建类胡萝卜素基因簇缺失突变体；通过HPLC和碘催化光异构化鉴定类胡萝卜素及其顺式异构体。
核心内容
该研究通过HPLC结合碘催化光异构化方法，系统分析了类胡萝卜素生物合成途径中的中间产物及其异构体，为解析合成相关基因功能提供了工具。研究者利用部分酶切和定向克隆构建了携带Erwinia herbicola类胡萝卜素基因簇的大肠杆菌LE392/pPL376缺失突变体，并通过HPLC鉴定各突变体积累的产物。结果显示，野生型转化子主要积累玉米黄素单糖苷和二糖苷，占比超过90%；缺失突变体del3仅积累15-顺式八氢番茄红素，del16积累两种番茄红素异构体，del17主要积累玉米黄素及少量β-隐黄质，而del22仅积累全反式β-胡萝卜素及其顺式异构体，据此定位了相关合成基因。此外，对斜生栅藻紫外突变体C-6D的分析表明，其在异养条件下积累多顺式类胡萝卜素，如prolycopene和proneurosporene，经碘催化光异构化后可转化为其他异构体。该方法有效分离并鉴定了途径中各类中间产物，为利用缺失突变体研究类胡萝卜素生物合成基因功能提供了可靠工具。
创新点
系统地描述了从微生物和藻类突变体中提取、分离和鉴定类胡萝卜素（包括多顺式类胡萝卜素）的方法，并给出了具体操作参数；通过缺失突变体定位了类胡萝卜素合成相关基因。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli LE392/pPL376 | 类胡萝卜素生物合成 | crtI | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | del3突变体中该基因失活，导致积累15-顺式八氢番茄红素 |
| Escherichia coli LE392/pPL376 | 类胡萝卜素生物合成 | crtZ | 番茄红素环化酶 | 催化 | del16突变体中该基因受损，导致积累番茄红素异构体 |
| Escherichia coli LE392/pPL376 | 类胡萝卜素生物合成 | crtH | β-胡萝卜素羟化酶/糖基化酶 | 催化 | del17中该基因无法表达β-胡萝卜素羟化酶；del22中该基因缺失导致糖基化步骤缺失，原文对同一crtH的定位存在歧义 |
关键发现
- 大肠杆菌LE392/pPL376含12.4 kb的Erwinia herbicola类胡萝卜素基因簇，积累的主要类胡萝卜素为玉米黄素单糖苷和二糖苷（>90%）。缺失突变体del3不积累有色类胡萝卜素，只积累15-顺式八氢番茄红素（Rt
- 1 min，吸收峰276/287/298 nm）；del16积累两种番茄红素异构体（Rt
- 8和18.5 min，吸收峰446/471/502 nm）；del17主要积累玉米黄素（Rt
- 8 min）及少量β-隐黄质（Rt
- 5 min）；del22仅积累全反式β-胡萝卜素（Rt
- 9 min）及其顺式异构体（Rt
- 7 min）。Scenedesmus obliquus突变体C-6D在异养条件下积累多顺式类胡萝卜素，如prolycopene、proneurosporene、pro-ζ-carotene、prophytofluene等，经碘催化光异构化后可转变成其他顺式或全反式异构体。
研究结论
该HPLC结合光异构化的方法可有效分析类胡萝卜素合成途径中的各种中间产物和异构体，为通过缺失突变体研究类胡萝卜素生物合成相关基因功能提供了有力工具。