Protection by Cloned Carotenoid Genes Expressed in Escherichia coli against Phototoxic Molecules Activated by Near-Ultraviolet Light
- 作者
- R. W. Tuveson, G. Sandmann
- 杂志
- Methods in Enzymology（1993）
- DOI
- 10.1016/0076-6879(93)14075-t
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
利用在大肠杆菌中异源表达的类胡萝卜素基因，评估类胡萝卜素对近紫外激活的光毒分子所造成损伤的保护作用，并区分其作用靶标与机制。
研究策略
构建携带类胡萝卜素生物合成基因的不同大肠杆菌菌株（无色素对照、积累β-胡萝卜素、积累番茄红素），在近紫外（320–400 nm）单独处理或与不同光敏剂联合处理下，测定细胞存活曲线，比较不同类胡萝卜素的保护效果。
核心内容
该研究构建了异源表达类胡萝卜素合成基因的大肠杆菌体系，用以评估类胡萝卜素对近紫外激活光毒分子所致损伤的保护作用。研究者将源自Erwinia herbicola的15.6 kb DNA片段导入大肠杆菌LE392和HB101，获得无色素对照、积累β-胡萝卜素和积累番茄红素等不同菌株，并在近紫外单独或联合光敏剂处理下测定细胞存活曲线。结果显示，类胡萝卜素合成在进入稳定期后约2.5小时启动；在α-三联噻吩加近紫外处理下，产β-胡萝卜素的菌株获得明显保护，而积累番茄红素的菌株与无色素对照同样敏感，HB101系列菌株的敏感性约为LE392的两倍。类胡萝卜素对单独近紫外仅在较高通量下提供有限保护，对过氧化氢无保护作用。这表明β-胡萝卜素通过淬灭三重态光敏剂或单线态氧保护细胞膜，而开环的番茄红素不具备此功能，保护效果取决于光敏剂在细胞内的分配及活性氧种类，该体系可用于类胡萝卜素光保护功能的评价。
创新点
建立了以大肠杆菌为底盘、异源表达类胡萝卜素基因来筛选和评估类胡萝卜素对近紫外激活光毒分子保护作用的实验体系；通过对比β-胡萝卜素与番茄红素（无环类胡萝卜素）的保护差异，揭示了类胡萝卜素结构对淬灭三重态光敏剂/单线态氧功能的影响。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli HB101 | 类胡萝卜素生物合成 | crtB | CrtB（前番茄红素焦磷酸合酶） | 催化 | 来自Erwinia herbicola，克隆于质粒pPL376 |
| Escherichia coli HB101 | 类胡萝卜素生物合成 | crtE | CrtE（八氢番茄红素合酶） | 催化 | 来自Erwinia herbicola，克隆于质粒pPL376 |
| Escherichia coli HB101 | 类胡萝卜素生物合成 | crtI | CrtI（八氢番茄红素脱氢酶） | 催化 | 来自Erwinia herbicola，克隆于质粒pPL376 |
| Escherichia coli LE392 | 类胡萝卜素生物合成 | crtB, crtE, crtI | CrtB, CrtE, CrtI | 催化 | 携带质粒pPL376，产β-胡萝卜素等 |
| Escherichia coli HB101 | 类胡萝卜素生物合成 | — | — | 催化 | 质粒pdel16为pPL376缺失1.9 kb Avl片段，导致番茄红素积累 |
关键发现
- 从Erwinia herbicola克隆的15.6 kb DNA片段使E. coli LE392(pPL376)产生八氢番茄红素、β-胡萝卜素、β-隐黄质、玉米黄质及其糖苷
- 类胡萝卜素合成在进入稳定期后约2.5小时开始
- 近紫外光源通量率为40–43 J s^-1 m^-2
- 在α-三联噻吩（10 μg/ml）加近紫外处理下，产β-胡萝卜素的菌株(pPL376)获得明显保护，而积累番茄红素的菌株(pdel16)与无色素对照同样敏感
- HB101系列菌株对α-三联噻吩加近紫外的敏感性约为LE392系列菌株的2倍
- 类胡萝卜素对单独近紫外仅在较高通量下提供有限保护，对H2O2（羟基自由基）无保护作用
- 无环类胡萝卜素（番茄红素）不能淬灭三重态光敏剂或单线态氧。
研究结论
类胡萝卜素通过淬灭三重态光敏剂或单线态氧，保护细胞膜免受某些氧依赖型近紫外激活光毒分子的致死损伤；其保护效果取决于光敏剂在细胞内的分配及产生的活性氧种类。该系统可用于评价不同类胡萝卜素的光保护功能。