Functional Analysis and Purification of Enzymes for Carotenoid Biosynthesis Expressed in Photosynthetic Bacteria
- 作者
- Glenn E. Bartley, Anette Kumle, Peter Beyer, Pablo A. Scolnik
- 杂志
- Methods in Enzymology（1993）
- DOI
- 10.1016/0076-6879(93)14081-s
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
类胡萝卜素脱氢酶（特别是八氢番茄红素脱氢酶）是膜结合酶，难以在体外检测活性和纯化；同时不同来源的酶催化步数不同，需要有效的异源表达和功能表征体系。本文旨在建立通过光合细菌Rhodobacter capsulatus进行功能互补表达和从过表达菌株纯化CrtI蛋白的方法。
研究策略
采用遗传互补与生化纯化相结合的策略：构建基于nifHDK启动子的诱导型质粒，在R. capsulatus类胡萝卜素突变体中表达同源/异源脱氢酶基因，通过类胡萝卜素积累类型判断酶催化步数；利用T7表达系统在E. coli中过表达蛋白制备抗体；使用CHAPS增溶、Ultrogel AcA 22凝胶过滤、羟磷灰石吸附和Mono Q阴离子交换层析纯化膜结合CrtI蛋白。
核心内容
本研究建立了一套光合细菌Rhodobacter capsulatus中类胡萝卜素脱氢酶的功能表征与膜蛋白纯化体系。通过构建由nifHDK启动子驱动的诱导型质粒，在类胡萝卜素合成缺陷突变体BPY69中异源表达来自不同物种的八氢番茄红素脱氢酶基因，根据积累的类胡萝卜素种类判断酶催化步数：R. capsulatus自身CrtI催化三步脱氢生成神经孢菌素，粗糙脉孢菌Al-1催化六步脱氢导致番茄红素和3,4-脱氢番茄红素积累，而大豆Pds1仅催化两步生成ζ-胡萝卜素。纯化流程采用CHAPS增溶结合凝胶过滤、羟磷灰石吸附和Mono Q阴离子交换层析，从膜组分中获得表观同源二聚体的CrtI蛋白，SDS-PAGE银染呈单一蛋白带；纯化过程中蛋白浓度从细胞破碎后的5.5 mg/ml逐步降至凝胶过滤后的0.04 mg/ml。该遗传互补系统可快速判定不同来源脱氢酶的催化特性，所建立的膜蛋白纯化方法为类胡萝卜素合成酶的结构功能研究和抗体制备提供了实用工具。
创新点
建立了在光合细菌R. capsulatus中由nif启动子驱动的可诱导表达系统，可实现外源真核脱氢酶的功能表达；通过异源表达使R. capsulatus积累非天然的番茄红素、3,4-脱氢番茄红素和ζ-胡萝卜素，用于快速判定脱氢酶催化步数；首次报道了膜结合CrtI蛋白的完整纯化流程，纯化产物呈同源二聚体。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Rhodobacter capsulatus BPY69 | 类胡萝卜素生物合成 | crtI | CrtI（八氢番茄红素脱氢酶） | 催化 | BPY69含crtI点突变；携带pGBN4.2质粒过表达CrtI，用于纯化 |
| Rhodobacter capsulatus类胡萝卜素突变体 | 类胡萝卜素生物合成 | al-1 | Al-1（真菌八氢番茄红素脱氢酶） | 催化 | 来自Neurospora crassa，催化六步脱氢，表达后积累番茄红素和3,4-脱氢番茄红素 |
| Rhodobacter capsulatus类胡萝卜素突变体 | 类胡萝卜素生物合成 | pds1 | Pds1（大豆八氢番茄红素脱氢酶） | 催化 | 来自Glycine max，催化两步脱氢，产生ζ-胡萝卜素 |
| Rhodobacter capsulatus | 类胡萝卜素生物合成 | nifHDK启动子 | — | 调控 | 低氮诱导、氧/铵抑制，用于驱动外源基因在R. capsulatus中的表达 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 类胡萝卜素生物合成（异源基因过表达） | T7 RNA聚合酶基因（lacUV5控制） | T7 RNA聚合酶 | 调控 | 用于IPTG诱导外源蛋白表达，制备抗体 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 类胡萝卜素生物合成 | 外源脱氢酶cDNA（如crtI） | CrtI或其他脱氢酶 | 催化 | 使用pGBFL7E载体进行T7融合表达，用于SDS-PAGE及抗体生产 |
关键发现
- R. capsulatus CrtI催化八氢番茄红素三步脱氢生成神经孢菌素
- Neurospora crassa Al-1催化六步脱氢
- 大豆Pds1催化两步脱氢生成ζ-胡萝卜素。在R. capsulatus中表达al-1导致番茄红素和3,4-脱氢番茄红素积累，表达pds导致ζ-胡萝卜素积累。CrtI纯化过程中：细胞破碎后蛋白含量5.5 mg/ml，膜蛋白悬浮液4.1 mg/ml，CHAPS增溶上清2.6 mg/ml，凝胶过滤后阳性组分0.04 mg/ml
- 使用300 mM CHAPS（约30倍CMC）增溶，柱缓冲液含20 mM CHAPS（2倍CMC）
- 纯化的CrtI蛋白在凝胶过滤中呈表观同源二聚体，SDS-PAGE银染显示单一蛋白带。
研究结论
本文证明R. capsulatus的遗传互补系统能有效表征不同来源类胡萝卜素脱氢酶的催化特性，同时建立的膜蛋白纯化流程可以从过表达菌株中获得一定纯度的CrtI蛋白，为类胡萝卜素合成酶的结构与功能研究以及抗体制备提供了实用方法。