Regeneration of Intact Tobacco Plants Containing Full Length Copies of Genetically Engineered T-DNA, and Transmission of T-DNA to R1 Progeny
- 作者
- Kenneth A. Barton, Andrew N. Binns, Antonius J. M. Matzke, Mary-Dell Chilton
- 单位
- Biology Department, Washington University, St. Louis, Missouri 63130; Cetus Madison Corporation, 2208 Parview Road, Middleton, Wisconsin 53562; Department of Biology, University of Pennsylvania, Philadelphia, Pennsylvania 19104
- 杂志
- Cell（1983）
- DOI
- 10.1016/0092-8674(83)90288-x
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
解决 Ti 质粒 T-DNA 作为植物基因载体时致瘤基因阻碍转化细胞再生完整植株的问题，并实现外源基因及完整 T-DNA 稳定传递给后代。
研究策略
在农杆菌 pTiT37 质粒 T-DNA 的 rooty 基因座上，通过同源重组定点插入酵母乙醇脱氢酶 I 基因和细菌新霉素磷酸转移酶基因，获得'解除武装'的工程 Ti 质粒；用其转化烟草茎段，筛选可再生的转化细胞株系，再生成完整植株并检测 T-DNA 遗传。
核心内容
该研究针对农杆菌Ti质粒T-DNA作为植物基因载体时，致瘤基因阻碍转化细胞再生完整植株的核心问题，提出了一种“解除武装”的工程化策略。研究者通过同源重组，在pTiT37质粒T-DNA的rooty基因座上定点插入了酵母乙醇脱氢酶I基因和细菌新霉素磷酸转移酶基因，构建了丧失致瘤性但保留转移能力的工程Ti质粒。用该质粒转化烟草茎段后，筛选出可再生的转化细胞株系并成功再生成完整植株。关键结果显示，再生植株基因组中整合了约20拷贝的外源ADH I基因和完整T-DNA；自交获得的R1后代中23%（46/200）检出nopaline阳性，Southern分析证实这些幼苗均含多拷贝完整T-DNA，但nopaline表达水平与T-DNA拷贝数不相关。再生植株表型基本正常，酵母ADH I基因在烟草中未检测到表达产物。该研究首次证明在rooty位点插入外源基因可获得能再生完整植物且稳定遗传的Ti质粒载体，为高等植物基因工程提供了实用工具。
创新点
首次在 rooty 位点插入外源基因获得能再生完整植物的农杆菌 Ti 质粒载体；证明完整 T-DNA 可经自交传给 R1 后代；发现 R1 幼苗中 nopaline 表达水平与 T-DNA 拷贝数不相关。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 乙醇发酵 | ADH I | 乙醇脱氢酶 I | 催化 | 外源报告基因，插入 T-DNA 后转入烟草，在烟草中未检测到表达 |
| Escherichia coli (Tn5) | 氨基糖苷类抗生素抗性 | nptII | 新霉素磷酸转移酶 II | 催化 | 筛选标记，赋予卡那霉素抗性 |
| Nicotiana tabacum var. Havana 425 | 胭脂碱合成 | nos | 胭脂碱合酶 | 催化 | T-DNA 携带，在再生植物及 R1 幼苗中表达，但表达水平有变异 |
| Agrobacterium tumefaciens (A208) | T-DNA 转移 | rooty locus 基因（未命名） | — | 催化 | 通过插入外源 DNA 使该位点失活，改变激素平衡，导致肿瘤减弱并可再生植株 |
关键发现
- HADH2 克隆中 39/48 (约81%) 为 nopaline 阳性，HADH4 为 2/40，H14a/a 为 2/45
- 再生植株含约 20 拷贝/基因组的外源 ADH I 基因和完整 T-DNA
- R1 幼苗中 46/200 (23%) 检出 nopaline
- Southern 分析显示 R1 幼苗均含多拷贝完整 T-DNA，但 nopaline 表达水平与拷贝数不相关
- 再生植物表型基本正常，仅少数轻微差异
- 酵母 ADH I 基因在烟草中未检测到表达产物。
研究结论
通过在 rooty 基因座插入外源 DNA 可解除 pTiT37 的致瘤性，形成能再生成完整植株并稳定遗传外源基因的 T-DNA 载体，为高等植物基因工程提供了实用工具。