高级醇 · 代谢工程文献库

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Yeast Surface Display of Two Proteins Previously Shown to Be Protective Against White Spot Syndrome Virus (WSSV) in Shrimp

作者
Vorawit Ananphongmanee, Jiraporn Srisala, Kallaya Sritunyalucksana, Chuenchit Boonchird
单位
Department of Biotechnology, Faculty of Science, Mahidol University, Bangkok, Thailand; Shrimp- Virus Interaction Laboratory (ASVI), National Center for Genetic Engineering and Biotechnology (BIOTEC), National Science and Technology Development Agency (NSTDA), Bangkok, Thailand; Center of Excellence for Shrimp Molecular Biology and Biotechnology, Faculty of Science, Mahidol University, Bangkok, Thailand
杂志
PLoS ONE（2015）
DOI
10.1371/journal.pone.0128764
所属领域
合成生物学
关键词
PmRab7VP28口服疫苗毕赤酵母白斑综合征病毒酵母表面展示
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解决的核心问题

如何将PmRab7和VP28两种蛋白展示在毕赤酵母细胞表面，并保持其结合活性，以便用于口服给药保护虾免受WSSV感染。

研究策略

利用酿酒酵母α-凝集素的GPI锚定结构域，将mPmRab7和pVP28分别与C端半段α-凝集素融合，构建AOX1启动子控制的表达盒，转化毕赤酵母KM71，经甲醇诱导表达后，通过免疫荧光、ELISA、流式细胞术和凝集实验验证表面展示及结合活性。

研究路线图

100%
研究问题：如何展示PmRab7和VP28蛋白于毕赤酵母表面并保持结合活性
策略：α-凝集素GPI锚定融合表达
关键改造：mPmRab7/α-agglutinin融合
关键改造：pVP28/α-agglutinin融合
结果：表面展示验证与结合活性
结论：可行口服抗WSSV工程酵母
验证方法：免疫荧光·ELISA·流式
表达系统：AOX1启动子·KM71
凝集结果：38%凝集率·90%表达
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核心内容

本研究利用酿酒酵母α-凝集素的GPI锚定结构域，将两种对虾白斑综合征病毒（WSSV）具有保护作用的蛋白mPmRab7和pVP28分别与α-凝集素C端融合，构建由AOX1启动子控制的表达盒并转化毕赤酵母KM71，通过甲醇诱导实现细胞表面展示。免疫荧光和流式细胞术证实蛋白定位于细胞表面，约90%和70%的细胞分别表达mPmRab7和pVP28，而对照组非特异荧光约20%。ELISA显示表面蛋白在250 μg/mL抗体浓度下达到饱和，竞争ELISA表明两种展示蛋白在7500–20000 ng/mL浓度范围内可与游离对应蛋白饱和结合。凝集实验中互补酵母细胞在48 h诱导时最大凝集率达38%，加入特异性抗体后凝集抑制率超过90%，证明展示蛋白保持了相互结合活性。该研究首次在毕赤酵母中实现了无需药物抗性标记的表面展示系统，为口服递送抗病毒蛋白、保护对虾抵御WSSV感染提供了可行的工程酵母载体基础。

创新点

首次在毕赤酵母中实现了无需药物抗性标记的细胞表面展示系统，适用于口服生物活性蛋白；成功展示了两种互补结合蛋白并验证了其相互结合能力，为口服抗病毒制剂提供基础。

研究对象（3）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Pichia pastoris KM71 细胞表面展示 mPmRab7 mPmRab7 转运 突变型PmRab7，去除了BglII位点和CSC前酰化基序，与α-凝集素GPI锚定域融合，展示在细胞表面并保留VP28结合活性
Pichia pastoris KM71 细胞表面展示 pVP28 pVP28 转运 截短型VP28，去除信号肽和跨膜域，与α-凝集素GPI锚定域融合，展示在细胞表面并保留PmRab7结合活性
Pichia pastoris KM71 细胞表面展示 AGα1 α-agglutinin 区室化 来自酿酒酵母的GPI锚定蛋白，其C端半段用于将目标蛋白锚定在酵母细胞壁表面

关键发现

  1. 成功在毕赤酵母细胞表面展示mPmRab7和pVP28
  2. 免疫荧光显示蛋白定位于细胞表面
  3. ELISA定量显示表面蛋白在250 μg/mL抗体浓度下达到饱和
  4. 竞争ELISA显示mPmRab7与游离VP28、pVP28与游离PmRab7的结合在7500–20000 ng/mL浓度范围内饱和
  5. 凝集实验显示互补酵母细胞在48 h诱导时最大凝集率为38%，加入特异性抗体后凝集抑制率超过90%
  6. 流式细胞术显示约90%和70%的细胞分别表达mPmRab7和pVP28，对照组非特异荧光约20%。

研究结论

本研究成功在毕赤酵母细胞表面展示了具有生物活性的mPmRab7和pVP28蛋白，两者均保持了相互结合能力，为后续口服给药保护虾抵御WSSV感染提供了可行的工程酵母载体。