An Enzymatic Platform for the Synthesis of Isoprenoid Precursors
- 作者
- Sofia B. Rodriguez, Thomas S. Leyh
- 单位
- Department of Microbiology & Immunology, The Albert Einstein College of Medicine, Bronx, New York, United States of America
- 杂志
- PLoS ONE（2014）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0105594
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
异戊二烯类化合物结构复杂，很多只能依赖天然提取，成本高且风险大；通过微生物发酵生产也面临产量和效率瓶颈。本文旨在开发一种体外酶促平台，高效合成异戊二烯前体异戊烯基焦磷酸（IPP）和二磷酸甲羟戊酸（DPM），从而为异戊二烯类药物和燃料的商业化生产提供替代途径。
研究策略
将HMG-CoA还原酶途径（产生甲羟戊酸）与甲羟戊酸途径连接，利用十种酶在单锅反应中从乙酸、ATP、NAD(P)H和CoA合成异戊二烯前体；通过丙酮酸激酶、肌激酶回收ADP/AMP为ATP，并通过无机焦磷酸酶水解焦磷酸，避免产物抑制并推动反应向产物方向进行；同时利用区域特异性同位素标记策略合成多种DPM同位素异构体。
核心内容
本研究构建了一个体外多酶单锅催化平台，用于从廉价底物高效合成异戊二烯前体异戊烯基焦磷酸（IPP）和二磷酸甲羟戊酸（DPM）。该平台将HMG-CoA还原酶途径与甲羟戊酸途径相连接，共使用十种酶，并以丙酮酸激酶和肌激酶再生ATP、以无机焦磷酸酶水解焦磷酸以解除产物抑制。在标准反应中，约98%的乙酸被转化为DPM；高浓度条件下，从乙酸出发的DPM和IPP产量分别达到22 g/L和18 g/L，而从外消旋甲羟戊酸出发则分别可达42 g/L和35 g/L，转化率约73%—77%，显著优于工程酵母或大肠杆菌高密度发酵生产青蒿酸的水平（23 g/L）。此外，该平台还实现了区域特异性同位素标记，可高效合成氘代和碳-13标记的DPM异构体，标记效率超过95%。纯化后的DPM回收率约为理论最大值的86%。这一体外酶促体系在简单水溶液中即可达到20—40 g/L的产物浓度，且无需复杂发酵控制，为萜类药物和燃料的可持续生产提供了一条具有竞争力的替代路线。
创新点
['建立了高效、高转化率的体外多酶单锅合成体系，从乙酸合成DPM的转化率约98%。', '开发了区域特异性同位素标记策略，可合成多种氘代和碳-13标记的DPM同位素异构体，标记效率>95%。', '在简单水溶液中实现了高浓度产物合成：DPM和IPP产量分别达到42 g/L和35 g/L（从甲羟戊酸出发），媲美或超过高密度发酵水平。']
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甲羟戊酸途径 | acs1 | 乙酰-CoA合成酶 (ACS) | 催化 | 催化乙酸与CoA酯化生成乙酰-CoA；来源于S. cerevisiae，商品化酶 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甲羟戊酸途径 | mvaE | 乙酰乙酰-CoA硫解酶 (ACT) | 催化 | 催化两分子乙酰-CoA缩合为乙酰乙酰-CoA；来源于E. faecalis，双功能酶N端结构域 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甲羟戊酸途径 | mvaS | HMG-CoA合酶 (HMGS) | 催化 | 催化乙酰乙酰-CoA与乙酰-CoA缩合生成HMG-CoA；来源于E. faecalis |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甲羟戊酸途径 | mvaE | HMG-CoA还原酶 (HMGR) | 催化 | 催化HMG-CoA还原为甲羟戊酸；来源于E. faecalis，双功能酶C端结构域，使用NADPH |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甲羟戊酸途径 | mvaK1 | 甲羟戊酸激酶 (MVK) | 催化 | 催化甲羟戊酸磷酸化为5-磷酸甲羟戊酸；来源于S. aureus，不受DPM变构抑制 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甲羟戊酸途径 | mvaK2 | 磷酸甲羟戊酸激酶 (PMK) | 催化 | 催化5-磷酸甲羟戊酸转化为5-焦磷酸甲羟戊酸；来源于S. pneumoniae |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甲羟戊酸途径 | — | 二磷酸甲羟戊酸脱羧酶 (DPM-DC) | 催化 | 催化二磷酸甲羟戊酸脱羧生成异戊烯基焦磷酸（IPP）；来源于S. pneumoniae，用于合成IPP |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甲羟戊酸途径 | PKM2 | 丙酮酸激酶 (PK) | 催化 | 催化PEP转化为丙酮酸并再生ATP；来源于O. cuniculus，商品化酶，用于辅因子循环 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甲羟戊酸途径 | AK1 | 肌激酶 (MK, myokinase) | 催化 | 催化AMP转化为ADP，配合丙酮酸激酶再生ATP；来源于O. cuniculus，商品化酶 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甲羟戊酸途径 | Ppa1 | 无机焦磷酸酶 (PPase) | 催化 | 水解焦磷酸为磷酸，驱动反应向前；来源于S. cerevisiae，商品化酶 |
关键发现
['在标准单锅反应中，约98%的乙酸被转化为DPM。', '高浓度条件下，从乙酸出发合成DPM和IPP的产量分别达到22 g/L和18 g/L，转化率分别为63%和69%。', '从(R/S)-甲羟戊酸出发合成DPM和IPP的产量分别达到42 g/L和35 g/L，转化率分别为73%和77%。', '同位素标记效率：氘代标记效率>98%（特异性>95%），[1-13C]DPM标记效率>92%（特异性>98%）。', '纯化后的DPM回收率约为理论最大值的86%。', '多数酶在室温下2天内活性损失≤20%，但乙酰乙酰CoA硫解酶和无机焦磷酸酶分别损失63%和72%的活性。', '与文献报道相比，工程化酵母产生青蒿酸100 mg/L，高密度发酵大肠杆菌产生青蒿酸23 g/L，而本平台产物浓度达到20-40 g/L。']
研究结论
本研究构建的体外酶促平台能够高效、高产量地合成异戊二烯前体DPM和IPP，产量达20-40 g/L，超过或媲美基因工程菌高密度发酵水平，且产物在简单水溶液中生成，易于分离纯化，为异戊二烯类化合物的可持续生产提供了有前景的替代方案。