A High-Throughput Colorimetric Screening Assay for Terpene Synthase Activity Based on Substrate Consumption
- 作者
- Maiko Furubayashi, Mayu Ikezumi, Jun Kajiwara, Miki Iwasaki, Akira Fujii, Ling Li, Kyoichi Saito, Daisuke Umeno
- 单位
- Department of Applied Chemistry and Biotechnology, Chiba University; Precursory Research for Embryonic Science and Technology (PRESTO), Japan Science and Technology Agency (JST)
- 杂志
- PLoS ONE（2014）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0093317
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
缺乏可靠的萜烯合酶活性高通量筛选方法，因为其底物和产物通常无色、结构多样且易挥发，严重限制了萜烯合酶的定向进化和突变分析。
研究策略
利用萜烯合酶与类胡萝卜素生物合成途径竞争共同的异戊二烯底物（FPP/GGPP），通过检测宿主细胞色素损失来评估萜烯合酶的活性，实现基于底物消耗的视觉化高通量筛选。
核心内容
针对萜烯合酶底物与产物无色、易挥发，缺乏通用高通量筛选方法的问题，本研究在大肠杆菌中开发了一种基于底物消耗的比色筛选策略。该策略利用萜烯合酶与类胡萝卜素生物合成途径竞争共同的异戊二烯底物（FPP或GGPP），当萜烯合酶消耗底物时，宿主细胞因类胡萝卜素合成受阻而呈现颜色损失，从而通过肉眼或仪器快速判断酶活性。借助C30与C40类胡萝卜素途径对底物链长的特异性，该方法还能区分FPP与GGPP消耗者。研究验证了该方法可检测二萜合酶TXS、倍半萜合酶TEAS、单萜合酶GES以及FDS变体的活性，并将其成功用于突变体库筛选和定向进化：从约2000个TEAS突变体中筛得42个白色菌落，其中TEASmut7（Q481R）和TEASmut11（L399R）使色素产量降至20–40 μg/g DCW，显著低于野生型TEAS的50 μg/g DCW和失活突变体的约250 μg/g DCW；TXS突变库中红色菌落平均含3.5个氨基酸替换，而白色菌落大多无替换。此外，GES截短分析表明第69位截短体仍保持活性，而更短截短体失去活性且不可溶。该比色方法为萜烯合酶的突变分析、定向进化和底物特异性研究提供了简单高效的通用工具。
创新点
开发了一种基于底物消耗的通用比色筛选方法，适用于任意产物类型的萜烯合酶和异戊烯基转移酶；利用C30和C40类胡萝卜素途径的底物大小特异性，可实现FPP与GGPP消耗活性的区分；成功用于突变体库筛选、TEAS定向进化及GES截短分析。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| E. coli XL1-Blue | C40类胡萝卜素生物合成（番茄红素） | crtE, crtB, crtI | CrtE, CrtB, CrtI | 催化 | 来自Pantoea ananatis，crtE为GGPP合酶，crtB为八氢番茄红素合酶，crtI为八氢番茄红素脱氢酶；用于构建pAC-EBI筛选质粒 |
| E. coli XL1-Blue | C30类胡萝卜素生物合成（diaponeurosporene） | crtM, crtN | CrtM, CrtN | 催化 | 来自Staphylococcus aureus，crtM为diapphytone synthase，crtN为diapphytone desaturase；用于构建pAC-MN筛选质粒 |
| E. coli | 二萜生物合成（紫杉醇前体） | TXS (taxadiene synthase) | TXS-M60 | 催化 | 来自太平洋红豆杉，截短N端信号肽的活性形式，消耗GGPP；D613A突变导致失活 |
| E. coli | 倍半萜生物合成（5-epi-aristolochene） | TEAS (5-epi-aristolochene synthase) | TEAS | 催化 | 来自烟草，kcat约0.04 s^-1，消耗FPP；D301A突变导致失活；定向进化获得Q481R和L399R活性提高变体 |
| E. coli | 单萜生物合成（香叶醇） | GES (geraniol synthase) | GES | 催化 | 来自罗勒（Ocimum basilicum），消耗GPP；D323A突变导致失活；N端截短至第69位仍保持活性 |
| E. coli | 异戊二烯焦磷酸合成 | fds (farnesyl diphosphate synthase) | FDS及其变体FDSY81A、FDSY81M | 催化 | 来自Geobacillus stearothermophilus，Y81M变体特异性合成GGPP，Y81A变体合成GFPP；用于验证筛选系统区分FPP/GGPP消耗能力 |
| E. coli | MEP途径/异戊二烯代谢 | idi | Idi (isopentenyl diphosphate isomerase) | 催化 | 异戊烯基焦磷酸异构酶，用于提高FPP供应，增强类胡萝卜素和萜烯产量 |
| E. coli | 异戊二烯焦磷酸合成 | ispA | IspA (FPP/GPP synthase) | 催化 | 内源法尼基焦磷酸合酶，分步释放GPP中间体，使单萜合酶可与C30类胡萝卜素途径竞争 |
关键发现
- 该方法可检测TXS（二萜合酶）、TEAS（倍半萜合酶）、GES（单萜合酶）及FDS变体的活性
- TEAS的kcat约为0.04 s^-1
- TEAS与pAC-MN共表达使C30类胡萝卜素显著降低，而TEASD301A无此效果
- TXS突变库中红色菌落平均含3.5个突变，而白色菌落大多无氨基酸替换（16个红色菌落中共发现53个氨基酸替换、1个移码和2个终止密码子）
- 从约2000个TEAS突变体库中筛得42个白色菌落，其中TEASmut7（Q481R）和TEASmut11（L399R）使色素产量降至20-40 μg/g DCW（野生型TEAS为50 μg/g DCW，失活突变体约250 μg/g DCW）
- GES截短至第69位（M69）仍保持活性，而M77和M99几乎无活性且不可溶。
研究结论
该比色筛选方法可简单高效地检测和评估萜烯合酶及异戊烯基转移酶的细胞活性，适用于突变分析和定向进化，并能区分FPP与GGPP消耗者，为萜烯合酶工程提供了有力工具。