Functional Characterization of the Xanthophyllomyces dendrorhous Farnesyl Pyrophosphate Synthase and Geranylgeranyl Pyrophosphate Synthase Encoding Genes That Are Involved in the Synthesis of Isoprenoid Precursors
- 作者
- Jennifer Alcaino, Ignacio Romero, Mauricio Niklitschek, Dionisia Sepúlveda, María Cecilia Rojas, Marcelo Baeza, Victor Cifuentes
- 单位
- Departamento de Ciencias Ecológicas, Facultad de Ciencias, Universidad de Chile, Santiago, Chile; Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad de Chile, Santiago, Chile
- 杂志
- PLoS ONE（2014）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0096626
- 所属领域
- 代谢工程/合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
阐明Xanthophyllomyces dendrorhous中从异戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）合成香叶基香叶基焦磷酸（GGPP）的关键酶学步骤，并评估FPS和crtE基因对类胡萝卜素（尤其是虾青素）生物合成的影响，为代谢工程改造提供靶点。
研究策略
从X. dendrorhous中克隆FPS基因，在E. coli中异源表达FPS和crtE基因并进行体外酶活测定；通过基因敲除（杂合缺失）和过表达构建X. dendrorhous突变株，分析类胡萝卜素和麦角固醇含量及组成，并结合RT-qPCR检测相关基因转录水平。
核心内容
该研究首次克隆并功能表征了法夫酵母中法尼基焦磷酸合酶基因FPS，与crtE基因共同阐明了类异戊二烯前体香叶基香叶基焦磷酸（GGPP）的合成步骤。研究者在大肠杆菌中异源表达两种酶并进行体外活性测定，结果显示FPS以DMAPP为底物时主要生成C15产物（87.1%），crtE则仅能以FPP为底物生成C20产物，两者依次催化IPP/DMAPP经GPP、FPP最终合成GGPP。在法夫酵母中过表达FPS使总酶活提高85%，crtE过表达使FPP底物酶活提高144%；培养72小时后，FPS和crtE过表达菌株的总类胡萝卜素分别达472.9和513.4 ppm，较野生型（376.3 ppm）显著提升，且虾青素比例由81.3%升至90.6%和87.9%。杂合缺失突变体虽总类胡萝卜素无明显变化，但虾青素比例下降至约54%，中间产物积累。crtE过表达还使麦角固醇含量增加约36%。结果表明FPS和crtE是提升虾青素产量的有效代谢工程靶点。
创新点
首次正式报道并功能表征X. dendrorhous的FPS基因，证明FPS编码FPP合酶，crtE编码GGPP合酶，两者依次作用合成GGPP；通过基因剂量调控证明FPS和crtE是提高虾青素产量的有效靶点。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Xanthophyllomyces dendrorhous (UCD 67-385) | 类异戊二烯/类胡萝卜素生物合成 | FPS | 法尼基焦磷酸合酶 (FPP synthase) | 催化 | 催化IPP+DMAPP生成GPP，再催化IPP+GPP生成FPP |
| Xanthophyllomyces dendrorhous (UCD 67-385) | 类异戊二烯/类胡萝卜素生物合成 | crtE | 香叶基香叶基焦磷酸合酶 (GGPP synthase) | 催化 | 催化FPP+IPP生成GGPP，是类胡萝卜素前体合成的限速步骤 |
| Escherichia coli BL21 | 异源表达 | FPS | 法尼基焦磷酸合酶 | 催化 | 用于体外酶活功能验证 |
| Escherichia coli BL21 | 异源表达 | crtE | 香叶基香叶基焦磷酸合酶 | 催化 | 用于体外酶活功能验证 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous (UCD 67-385) | 类胡萝卜素生物合成 | crtS | 虾青素合酶 (astaxanthin synthase) | 催化 | P450酶，催化β-胡萝卜素转化为虾青素 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous (UCD 67-385) | 类胡萝卜素生物合成 | crtR | 细胞色素P450还原酶 (CPR) | 催化 | 为crtS提供电子，杂合突变株中其转录水平显著下降，影响虾青素合成 |
关键发现
- FPS基因编码355个氨基酸（预测分子量40.24 kDa），crtE基因编码376个氨基酸（42.16 kDa）
- 体外酶活测定显示BL21+FPS以DMAPP为底物时总酶活为6.06±0.75 U/mg×10^6，产物含C10（12.9%）和C15（87.1%），以GPP为底物时生成C15（100%）
- BL21+crtE仅以FPP为底物生成C20（活性2.44±0.16 U/mg×10^6），不能利用DMAPP或GPP
- 两者混合提取物可将DMAPP+IPP转化为C20。X. dendrorhous野生型以DMAPP为底物时酶活为5.0±0.15 U/mg×10^6，产物C10 2%、C15 86%、C20 12%
- FPS过表达菌株酶活提高85%，crtE过表达菌株以FPP为底物酶活提高144%。72h培养时野生型总类胡萝卜素376.3±5.52 ppm，FPS过表达菌株472.9±25.6 ppm，crtE过表达菌株513.4±12.9 ppm
- 120h时野生型436.4±11.5 ppm，FPS过表达514.9±4.1 ppm，crtE过表达559.1±30.3 ppm。过表达菌株虾青素比例提高（72h: 90.6%和87.9% vs 野生型81.3%），杂合缺失突变体总类胡萝卜素无显著变化但虾青素比例下降（54.2%和54.9%），中间产物（β-胡萝卜素、海胆酮等）积累。crtE过表达菌株麦角固醇含量较野生型增加约36%。
研究结论
在X. dendrorhous中，GGPP由FPS编码的FPP合酶和crtE编码的GGPP合酶依次作用合成：FPS先催化IPP与DMAPP生成GPP，再加成IPP生成FPP；crtE催化FPP与IPP生成GGPP。FPS和crtE基因过表达可提高类胡萝卜素尤其是虾青素的产量，是代谢工程改造的良好靶点。