高级醇 · 代谢工程文献库

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Generation of the improved recombinant xylose-utilizing Saccharomyces cerevisiae TMB 3400 by random mutagenesis and physiological comparison with Pichia stipitis CBS 6054

作者
C. Fredrik Wahlbom, Willem H. van Zyl, Leif J. Jönsson, Bärbel Hahn-Hägerdal, Ricardo R. Cordero Otero
单位
Department of Applied Microbiology, Lund University, P.O. Box 124, 22100 Lund, Sweden; Department of Microbiology, University of Stellenbosch, Stellenbosch 7600, South Africa
杂志
FEMS Yeast Research（2003）
DOI
10.1016/S1567-1356(02)00206-4
所属领域
代谢工程
关键词
D-XyloseEthanolMutagenesisPichia stipitisSaccharomyces cerevisiae
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解决的核心问题

野生型酿酒酵母不能有效利用木糖生产乙醇，需要构建高效利用木糖的重组酿酒酵母菌株。

研究策略

通过代谢工程将P. stipitis的木糖还原酶（XR）、木糖醇脱氢酶（XDH）基因和酿酒酵母自身的木酮糖激酶（XK）基因整合到工业酿酒酵母USM21染色体上，获得基础菌株TMB 3399；再经EMS化学诱变和富集筛选，获得木糖利用能力显著提高的突变株TMB 3400，并与天然木糖利用菌株P. stipitis CBS 6054进行系统的生理比较。

研究路线图

100%
研究问题：野生型酿酒酵母无法高效利用木糖产乙醇
策略：代谢工程整合XR、XDH、XK基因至USM21染色体，构建TMB 3399
关键改造：EMS化学诱变+富集筛选获得突变株TMB 3400
结果1：TMB 3400最大比生长速率提升5倍（0.14 h⁻¹）
结果2：氧受限下乙醇得率0.25 g/g，比生产力0.10 g/g/h
结果3：突变株XR、XDH、XK比活力均高于出发菌株
结果4：与天然菌株P. stipitis CBS 6054比较：其生长速率和乙醇得率更高
结论：代谢工程+随机诱变有效改善木糖利用与乙醇生产；P. stipitis为改进基准；酿酒酵母工业适应性更强
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核心内容

该研究针对野生型酿酒酵母无法有效利用木糖生产乙醇的问题，将P. stipitis的木糖还原酶、木糖醇脱氢酶基因及内源木酮糖激酶基因整合入工业菌株USM21染色体，获得基础菌株TMB 3399，随后经EMS化学诱变筛选得到突变株TMB 3400，并与天然木糖利用菌株P. stipitis CBS 6054进行生理比较。结果显示，诱变使最大比生长速率提高5倍以上，从TMB 3399的0.0255 h⁻¹升至TMB 3400的0.14 h⁻¹；氧受限条件下乙醇得率分别为0.21、0.25和0.30 g/g木糖，比生产力依次为0.001、0.10和0.16 g/g生物量/h；厌氧条件下TMB 3399的木糖醇得率约为TMB 3400的2.4倍，而TMB 3400的甘油产量更高。TMB 3400的XR、XDH、XK比活力均显著高于TMB 3399，且首次在限定培养基中证明该突变株能以木糖为唯一碳源进行生长和能量代谢。虽然P. stipitis在厌氧条件下乙醇得率和生产力分别为TMB 3400的2.2倍和4.6倍，但酿酒酵母的工业适应性与乙醇耐受性使其更具开发前景，该策略为重组木糖利用酵母的进一步优化提供了参考。

创新点

将代谢工程与随机诱变相结合，成功获得木糖利用和乙醇生产效率显著提高的酿酒酵母突变株；首次在限定培养基中好氧培养重组木糖利用酿酒酵母，并严格证明其能以木糖为唯一碳源进行生长和能量代谢。

研究对象（10）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Saccharomyces cerevisiae TMB 3399/TMB 3400 木糖代谢 xyl1 D-xylose reductase (XR) 催化 来自Pichia stipitis，经染色体整合表达，催化木糖还原为木糖醇
Saccharomyces cerevisiae TMB 3399/TMB 3400 木糖代谢 xyl2 xylitol dehydrogenase (XDH) 催化 来自Pichia stipitis，经染色体整合表达，催化木糖醇氧化为木酮糖
Saccharomyces cerevisiae TMB 3399/TMB 3400 木糖代谢 XKS1 xylulokinase (XK) 催化 酿酒酵母内源基因的额外拷贝，经染色体整合表达，催化木酮糖磷酸化为5-磷酸木酮糖
Saccharomyces cerevisiae TMB 3399/TMB 3400 乙醇发酵 — pyruvate decarboxylase (PDC) 催化 内源酶，在所有通气条件下均表达，催化丙酮酸脱羧生成乙醛
Saccharomyces cerevisiae TMB 3399/TMB 3400 乙醇发酵 — alcohol dehydrogenase (ADH) 催化 内源酶，在所有通气条件下均表达，催化乙醛还原为乙醇
Pichia stipitis CBS 6054 木糖代谢 xyl1 D-xylose reductase (XR) 催化 天然木糖利用菌株，XR活性高于XDH，在好氧条件下活性达2.1 U/mg蛋白
Pichia stipitis CBS 6054 木糖代谢 xyl2 xylitol dehydrogenase (XDH) 催化 天然木糖利用菌株，好氧条件下活性0.4 U/mg蛋白，低于XR
Pichia stipitis CBS 6054 木糖代谢 — xylulokinase (XK) 催化 天然木糖利用菌株，好氧条件下活性0.14 U/mg蛋白
Pichia stipitis CBS 6054 乙醇发酵 — pyruvate decarboxylase (PDC) 催化 仅在氧受限和厌氧条件下表达，好氧条件下未检出
Pichia stipitis CBS 6054 乙醇发酵 — alcohol dehydrogenase (ADH) 催化 仅在氧受限和厌氧条件下表达，好氧条件下未检出

关键发现

  1. 突变使最大比生长速率提高5倍以上（TMB 3399为0.0255 h^-1，TMB 3400为0.14 h^-1，P. stipitis为0.44 h^-1）；氧受限条件下乙醇得率分别为0.21、0.25和0.30 g乙醇/g木糖，比乙醇生产力分别为0.001、0.10和0.16 g乙醇/g生物量/h；厌氧条件下木糖醇得率TMB 3399比TMB 3400高约2倍（0.59 vs
  2. 25 g/g），但甘油得率TMB 3400更高（1.1 vs
  3. 26 g/l）；TMB 3400的XR、XDH、XK比活力均高于TMB 3399（如好氧下XR
  4. 1 vs
  5. 03，XDH
  6. 7 vs
  7. 34，XK
  8. 4 vs
  9. 22 U/mg蛋白）；P. stipitis在厌氧条件下乙醇得率和生产力分别是TMB 3400的2.2倍和4.6倍（0.40 vs
  10. 18 g/g，0.11 vs
  11. 024 g/g/h）。

研究结论

代谢工程与随机诱变相结合可有效改善酿酒酵母的木糖利用和乙醇生产性能，获得的TMB 3400能在限定培养基中以木糖为唯一碳源良好生长和产乙醇；天然木糖利用菌株P. stipitis CBS 6054仍具有更高的生长速率和乙醇得率，可作为进一步改进重组酿酒酵母的基准，但酿酒酵母的工业适应性和乙醇耐受性使其更具开发潜力。