Metabolic engineering of the astaxanthin-biosynthetic pathway of Xanthophyllomyces dendrorhous
- 作者
- Hans Visser, Albert J.J. van Ooyen, Jan C. Verdoes
- 单位
- Section of Fungal Genomics, Wageningen University, Dreijenlaan 2, 6703 HA Wageningen, The Netherlands; GenoClipp Biotechnology bv, L.J. Zielstraweg 1, 9713 GX Groningen, The Netherlands
- DOI
- 10.1016/S1567-1356(03)00158-2
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
野生型Xanthophyllomyces dendrorhous（法夫酵母）的虾青素产量较低（约200-400 μg/g干重），需提高10-50倍才能与化学合成虾青素竞争，因此需要开发有效的代谢工程策略来提升虾青素及类胡萝卜素产量。
研究策略
综述了通过培养条件优化、经典诱变（UV、EMS、NTG等）筛选高产突变株、原生质体融合以及基于重组DNA技术的基因失活/过表达（如crtYB、crtI、idi等）等策略来改造X. dendrorhous的虾青素生物合成途径。
核心内容
该研究系统综述并探讨了法夫酵母虾青素生物合成途径的代谢工程改造策略。针对野生型菌株虾青素产量仅约200–400 μg/g干重、难以与化学合成竞争的瓶颈，作者梳理了培养条件优化、经典诱变筛选、原生质体融合及重组DNA技术等多层次改造路线。通过克隆crtYB（编码八氢番茄红素合酶/番茄红素环化酶双功能酶）、crtI、idi等基因并开展基因敲除与过表达实验，揭示了途径中的限速步骤：过表达crtYB使总类胡萝卜素从256 μg/g增至465 μg/g（提高82%），但虾青素比例下降，而echinone从31 μg/g升至180 μg/g，表明下游环化与羟基化反应存在瓶颈；过表达crtI则导致总类胡萝卜素下降但单环中间产物积累。此外，在E. coli中表达idi使类胡萝卜素产量提高1.3–3倍，提示IPP异构酶活性对通量具有重要调控作用。经典诱变与融合杂交可获得产量达1392–1834 μg/g甚至超过3000 μg/g的菌株。这些结果证明了遗传操作对重塑类胡萝卜素组成和产量的有效性，但实现产业化仍需借助多组学手段解析更复杂的代谢调控网络。
创新点
系统总结了X. dendrorhous类胡萝卜素途径的分子工具和遗传操作方法；确定了crtYB编码双功能酶（八氢番茄红素合酶/番茄红素环化酶），并利用基因敲除和过表达揭示了途径中的限速步骤；通过异源互补克隆了多个类胡萝卜素合成基因。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 类胡萝卜素生物合成（甲羟戊酸途径） | crtYB | 八氢番茄红素合酶/番茄红素环化酶（双功能酶） | 催化 | 失活后菌株为白色、无类胡萝卜素；过表达导致β-胡萝卜素和echinone积累，表明氧化步骤限速。 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 类胡萝卜素生物合成 | crtI | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 过表达增加单环类胡萝卜素（torulene、HDCO），减少双环类胡萝卜素（echinone、β-胡萝卜素、虾青素）。 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 异戊二烯生物合成（甲羟戊酸途径） | idi | 异戊烯基二磷酸异构酶 | 催化 | 在E. coli中过表达使类胡萝卜素产量提高1.3-3倍。 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 类胡萝卜素生物合成 | crtE | 香叶基香叶基焦磷酸合酶 | 催化 | 通过异源互补从cDNA文库中克隆。 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 类胡萝卜素生物合成 | ast | 虾青素合酶（细胞色素P450） | 催化 | 可恢复β-胡萝卜素积累突变体的虾青素合成，具体催化反应尚未完全确定。 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 甲羟戊酸途径 | hmc | HMG-CoA合酶 | 催化 | 克隆了部分基因片段。 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 甲羟戊酸途径 | hmg | HMG-CoA还原酶 | 催化 | 克隆了部分基因片段；该酶可能是类胡萝卜素合成的潜在瓶颈。 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 甲羟戊酸途径 | mvk | 甲羟戊酸激酶 | 催化 | 克隆了部分基因片段。 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 甲羟戊酸途径 | mpd | 甲羟戊酸二磷酸脱羧酶 | 催化 | 克隆了部分基因片段。 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 甲羟戊酸途径 | fps | 法尼基二磷酸合酶 | 催化 | 克隆了部分基因片段。 |
关键发现
- ['野生型X. dendrorhous虾青素含量约200-400 μg/g干重，添加甲羟戊酸可使虾青素和总类胡萝卜素合成提高4倍。', '通过经典诱变获得的高产突变株虾青素含量提高2-9倍，如菌株N9达到1834 μg/g干重，J4-3为1392 μg/g干重
- 原生质体融合杂交菌株产生>2000 μg/g干重类胡萝卜素
- 工业菌株可产>3000-4000 μg/g干重。', '在E. coli中表达X. dendrorhous的idi基因使类胡萝卜素产量提高1.3-3倍，表明IPP异构酶活性在类胡萝卜素工程菌中可能是限速步骤。', '过表达crtYB基因（编码八氢番茄红素合酶/番茄红素环化酶）使总类胡萝卜素含量从256 μg/g增至最高465 μg/g（增加82%），但虾青素相对比例下降，而echinone和β-胡萝卜素积累显著增加（echinone从31增至180 μg/g）。', '过表达crtI基因（编码八氢番茄红素脱氢酶）使总类胡萝卜素从265 μg/g降至187/185 μg/g，但单环类胡萝卜素HDCO从42增至101 μg/g，torulene也增加
- 在β-胡萝卜素积累菌株PR-1-104中过表达crtI使torulene从0增至71 μg/g。', '通过单交换或双交换失活crtYB基因可获得白色表型、完全不能合成类胡萝卜素的重组菌株，证明基因特异性失活可行。', 'X. dendrorhous的转化效率在优化条件下可达1000个转化子/μg质粒DNA。']
研究结论
通过经典诱变和重组DNA技术能够有效改变X. dendrorhous的类胡萝卜素产量和组成，但为实现虾青素的产业化高效生产，需要结合多组学方法进一步解析代谢调控网络并进行代谢控制工程。