Acidophilic Xylanase from Aureobasidium pullulans: Efficient Expression and Secretion in Pichia pastoris and Mutational Analysis
- 作者
- HIDENORI TANAKA, TOMOKO OKUNO, SATOSHI MORIYAMA, MICHIO MUGURUMA, KAZUYOSHI OHTA
- 单位
- Department of Biochemistry and Applied Biosciences, Faculty of Agriculture, University of Miyazaki
- 杂志
- Journal of Bioscience and Bioengineering（2004）
- DOI
- 10.1016/S1389-1723(04)00292-0
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
实现Aureobasidium pullulans酸性木聚糖酶在毕赤酵母中的高效分泌表达，并鉴定其低pH最适性的关键氨基酸残基。
研究策略
利用AOX1启动子，比较XynI自身prepro信号肽、PHO1信号肽和α-MF前导肽对分泌效率的影响；通过同源建模构建3D结构，并对候选氨基酸进行定点突变，分析酶学性质变化。
核心内容
该研究首次在毕赤酵母中实现了出芽短梗霉来源酸性木聚糖酶XynI的功能性分泌表达，并借助同源建模与定点突变解析了其低pH适应性的分子基础。实验以AOX1启动子驱动表达，系统比较了三种信号肽的分泌效率，发现XynI自身prepro信号肽与α-MF前导肽效果相当，所得酶活均为38 U/ml，对应分泌浓度约178 mg/L和180 mg/L，显著高于PHO1信号肽（15 U/ml，约100 mg/L）及文献中黑曲霉木聚糖酶在毕赤酵母中的60 mg/L，证明该自身信号肽具备高效分泌能力。纯化后的重组酶比活为213 U/mg，回收率27.9%，最适pH为2.5、最适温度40°C，均略低于天然酶。突变分析显示D73N活性降至野生型的约19%且最适pH上移，E157Q则使最适pH升至3.5但保留全活性，而E153T无显著影响。结合三维结构，Asp-73与Glu-157分别位于活性位点裂缝上下边缘，共同决定酶的低pH最适性，为酸性木聚糖酶的理性改造提供了关键靶点。
创新点
首次在毕赤酵母中功能表达A. pullulans木聚糖酶，证明其自身信号肽可实现高效分泌（178 mg/L）；通过突变分析鉴定出Asp-73和Glu-157是决定低pH最适性的关键残基。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris GS115 | 甲醇利用 | AOX1 | 醇氧化酶 | 调控 | AOX1启动子用于甲醇诱导异源基因表达 |
| Pichia pastoris GS115 | 蛋白分泌通路 | xyn1信号肽编码区 | XynI prepro信号肽 | 区室化 | 34个氨基酸的prepro信号肽，引导目的蛋白高效分泌至胞外 |
| Pichia pastoris GS115 | 木聚糖降解 | xyn1 | XynI (endo-1,4-β-xylanase) | 催化 | 来自A. pullulans的酸性木聚糖酶，天然最适pH 2.0，重组酶最适pH 2.5 |
| Pichia pastoris GS115 | 木聚糖降解 | xyn1 (D73N突变) | XynI D73N | 催化 | 突变后活性降至野生型的约19%，最适pH上移，证实Asp-73对低pH催化重要 |
| Pichia pastoris GS115 | 木聚糖降解 | xyn1 (E157Q突变) | XynI E157Q | 催化 | 突变后最适pH升至3.5但保留全活性，Glu-157通过质子化影响底物结合 |
| Pichia pastoris GS115 | 木聚糖降解 | xyn1 (E153T突变) | XynI E153T | 催化 | 突变对活性及最适pH无显著影响，Glu-153非关键残基 |
| Pichia pastoris GS115 | 蛋白分泌通路 | PHO1信号肽 | PHO1信号肽 | 区室化 | 来自毕赤酵母酸性磷酸酶的pre型信号肽，分泌效率约为XynI信号肽的一半 |
| Pichia pastoris GS115 | 蛋白分泌通路 | MFα1前导肽 | α-交配因子前导肽 | 区室化 | 来自酿酒酵母的prepro前导肽，分泌效率与XynI信号肽相当 |
关键发现
- XynI信号肽和α-MF信号肽驱动的木聚糖酶活性均为38 U/ml，PHO1信号肽为15 U/ml，对应分泌浓度分别约为178 mg/L、180 mg/L和100 mg/L，高于文献报道的A. niger木聚糖酶在毕赤酵母中的60 mg/L。重组酶纯化回收率27.9%，比活213 U/mg，低于天然酶512 U/mg
- 重组酶最适pH为2.5（天然酶为2.0），最适温度40°C（较天然酶低10°C）。D73N突变体活性降至野生型的约19%，最适pH上移
- E157Q突变体最适pH移至3.5但保留全活性
- E153T突变体无显著变化
- V141C/C150Y双突变体无活性。
研究结论
A. pullulans木聚糖酶可在毕赤酵母中利用其自身信号肽高效分泌，且分泌效率优于PHO1信号肽；结合3D模型与定点突变，证明Asp-73和Glu-157分别位于活性位点裂缝的上、下边缘，共同决定酶的低pH最适性。