Engineering of Tomato Glandular Trichomes for the Production of Specialized Metabolites
- 作者
- R.W.J. Kortbeek, J. Xu, A. Ramirez, E. Spyropoulou, P. Diergaarde, I. Otten-Bruggeman, M. de Both, R. Nagel, A. Schmidt, R.C. Schuurink, P.M. Bleeker
- 单位
- Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam, Amsterdam, The Netherlands; Keygene N.V., Wageningen, The Netherlands; Max Planck Institute for Chemical Ecology, Jena, Germany
- 杂志
- Methods in Enzymology（2016）
- DOI
- 10.1016/bs.mie.2016.02.014
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何有效对番茄腺毛进行代谢工程以生产特化代谢物，尤其是实现启动子特异性验证和目标基因在腺毛中的稳定表达，并阐明代谢途径改造的实际效果。
研究策略
先采用微粒轰击瞬时转化体系快速验证候选启动子的腺毛特异性，再利用稳定的农杆菌介导转化实现目标基因在腺毛中的特异表达。以法尼基二磷酸合酶（FPS）为靶点，将其靶向质体以改变萜类前体供应，观察对萜类代谢的影响。
核心内容
该研究以番茄腺毛为对象，建立了一套系统的代谢工程流程。作者先利用微粒轰击瞬时转化体系快速验证启动子特异性，发现SITPS5启动子仅在type VI腺毛中驱动GUS表达；随后通过农杆菌介导的稳定转化，实现了SITPS9启动子在type VI腺毛四个头细胞中特异驱动YFP表达，确认了腺毛靶向表达工具的可靠性。在此基础上，将禽源法尼基二磷酸合酶（GgFPS）靶向质体以改变萜类前体供应，结果显示FPP含量较野生型提高约3.5倍，单萜β-水芹烯含量从1131.69 ng/mg骤降至2.48 ng/mg几乎消失，同时新产生倍半萜α-法尼烯（2.17 ng/mg）和(E)-橙花叔醇（137.42 ng/mg）。白粉虱选择试验中，转基因植株上的昆虫回收率仅14%，显著低于野生型的26%–32%。该研究证明腺毛代谢工程可行，但代谢通路的调控复杂，产物谱变化难以精确预测，其结果为番茄腺毛定向改造提供了方法学参考。
创新点
建立了基于微粒轰击的番茄腺毛瞬时转化方法，可快速验证启动子特异性；使用 SITPS9 启动子驱动报告基因在稳定转化植株中实现了 type VI 腺毛头细胞的特异表达；将禽源 FPS（GgFPS）靶向质体成功改变了萜类代谢格局，意外抑制单萜合成并产生倍半萜，展示了代谢工程的不可预测性。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 番茄 (Solanum lycopersicum cv. Moneymaker) | 萜类生物合成 | SITPS5 | 芳樟醇合酶 | 催化 | 其启动子经微粒轰击验证在 type VI 腺毛中特异表达；体外可同时利用 GPP 和 FPP |
| 番茄 (Solanum lycopersicum cv. Moneymaker) | 萜类生物合成 | SITPS9 | 萜烯合酶 | 催化 | 其启动子驱动 sYFP 在稳定转基因番茄 type VI 腺毛头细胞中特异表达 |
| 番茄 (Solanum lycopersicum cv. Moneymaker) | 萜类生物合成 (FPP 供给) | GgFPS | 法尼基二磷酸合酶 (Gallus gallus) | 催化 | 禽源 FPS，靶向质体表达，使 FPP 含量增加约 3.5 倍并引起萜类谱改变 |
| 番茄 (Solanum lycopersicum cv. Moneymaker) | 萜类生物合成 | SIFPS | 法尼基二磷酸合酶 (番茄) | 催化 | 内源 FPS，过表达时转录本增加有限，受转录后调控 |
| 番茄 (Solanum lycopersicum cv. Moneymaker) | — | — | Rubisco 小亚基信号肽 (ssu) | 区室化 | 用于将 FPS 靶向质体的信号肽 |
| 番茄 (Solanum lycopersicum cv. Moneymaker) | — | ShMKS1 启动子 | — | 调控 | 来自野生番茄 Solanum habrochaites 的 trichome 特异启动子，用于驱动 FPS 在腺毛中表达 |
关键发现
- 瞬时转化中 SITPS5 启动子仅在 type VI 腺毛中驱动 GUS 表达；稳定转化中 SITPS9 启动子在 type VI 腺毛四个头细胞中特异表达 YFP。过表达禽源 FPS 并靶向质体后，FPP 含量较野生型增加约
- 5 倍；单萜 β-水芹烯含量从野生型的
- 69 ng/mg 毛状体骤降至
- 48 ng/mg，几乎消失；同时新产生 α-法尼烯（2.17 ng/mg）和 (E)-橙花叔醇（137.42 ng/mg）。白粉虱选择试验中，转基因植株上的回收率为 14%，显著低于野生型的 26%、29% 和 32%（p<0.01）。内源 SIFPS 过表达仅使转录本适度增加，而 GgFPS 转录水平远高于 SIFPS 系。
研究结论
本文提供了番茄腺毛代谢工程的完整流程，包括瞬时微粒轰击验证启动子特异性和稳定转化实现基因表达。将 FPS 靶向质体导致 FPP 升高并产生倍半萜，但意外几乎完全抑制了单萜合成，影响白粉虱对植物的选择。结果表明腺毛代谢工程可行，但结果受复杂代谢调控影响，难以精确预测。