Quantifying the Metabolites of the Methylerythritol 4-Phosphate (MEP) Pathway in Plants and Bacteria by Liquid Chromatography-Triple Quadrupole Mass Spectrometry
- 作者
- D. González-Cabanelas, A. Hammerbacher, B. Raguschke, J. Gershenzon, L.P. Wright
- 单位
- Max Planck Institute for Chemical Ecology, Jena, Germany; Forestry and Agricultural Biotechnology Institute (FABI), University of Pretoria, Pretoria, South Africa
- 杂志
- Methods in Enzymology（2016）
- DOI
- 10.1016/bs.mie.2016.02.025
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
MEP途径中间体在生物样品中含量低且缺乏合适的内标，难以准确测定其浓度，需要开发灵敏、准确的定量方法。
研究策略
利用大肠杆菌在13C标记葡萄糖中培养制备稳定同位素标记的内标，结合亲水相互作用色谱（HILIC）与三重四极杆质谱（LC-MS/MS）实现MEP途径中间体的分离和定量，并优化了提取和分析条件。
核心内容
该研究针对MEP途径中间体含量低、缺乏合适内标导致难以准确定量的问题，开发了一种基于LC-MS/MS的灵敏定量方法。方法上，利用大肠杆菌在13C标记葡萄糖中培养制备稳定同位素标记的内标，获得超过80%的完全标记率；结合XBridge BEH Amide XP HILIC柱（pH 10.5、20 mM碳酸氢铵条件）与三重四极杆质谱，有效分离磷酸化代谢物，并通过内标校正同时补偿提取损失和离子抑制。在拟南芥叶片提取中，DXP、MEP、ME-CDP、MEcDP、IDP/DMADP的提取效率在24.2%至83.9%之间，离子抑制在55.3%至75.1%之间，LOD低至0.78 pmol/mL（IDP/DMADP）。该方法成功定量拟南芥中8个MEP中间体中的6个，测得拟南芥MEP通路通量为3.44 pmol/mg/min（21°C，140 μmol m^-2 s^-1光强）；过表达DXS后纯化获得约2 mg MEcDP（NMR纯度80%）。该方法适用于低类异戊二烯含量物种的MEP代谢物测定，为研究MEP途径调控和代谢工程改造提供了有力工具。
创新点
建立了批量制备MEP途径中间体稳定同位素内标的方法（超过80%完全标记）；采用XBridge BEH Amide XP HILIC柱在pH 10.5、20 mM碳酸氢铵条件下有效分离磷酸化代谢物；通过内标校正同时补偿提取损失和离子抑制，实现对微量代谢物的准确定量。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate (MEP) pathway | — | 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase (DXS) | 催化 | MEP途径第一步，本文通过过表达DXS增加通量，用于生产MEcDP内标 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate (MEP) pathway | — | DXP reductoisomerase (DXR) | 催化 | 催化DXP还原为MEP |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate (MEP) pathway | — | 4-(cytidine 5'-diphospho)-2-C-methyl-D-erythritol kinase (CMK) | 催化 | 催化ME-CDP磷酸化为MEP-CDP |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate (MEP) pathway | — | 2-C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate synthase (MDS) | 催化 | 催化ME-CDP环化为MEcDP |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate (MEP) pathway | — | (E)-4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate synthase (HDS) | 催化 | 催化MEcDP还原为HMBDP |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate (MEP) pathway | — | (E)-4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase (HDR) | 催化 | 催化HMBDP还原为IDP和DMADP |
关键发现
- 在E. coli BL21(DE3)中，MEP代谢物在生长5-6小时、OD600
- 3-1.6时含量最高，用13C标记葡萄糖可获得超过80%完全标记的内标。过表达DXS并诱导后，通过纤维素柱色谱可从培养基中纯化约2 mg MEcDP，NMR纯度80%。拟南芥MEP通路通量为3.44 pmol/mg/min（21°C，140 μmol m^-2 s^-1光强）。在拟南芥叶片提取中，DXP、MEP、ME-CDP、MEcDP、IDP/DMADP的提取效率分别为74.5%、62.9%、78.0%、83.9%、24.2%；离子抑制分别为65.7%、64.5%、75.1%、55.3%、58.3%；LOD分别为4.73
- 83
- 61
- 17
- 78 pmol/mL；LOQ分别为7.88
- 05
- 68
- 28
- 29 pmol/mL。该方法可定量拟南芥中8个MEP中间体中的6个（MEP-CDP不稳定，HMBDP低于LOQ）。
研究结论
开发了一种基于LC-MS/MS的灵敏方法，利用自制的稳定同位素内标，能够准确测定植物和细菌中MEP途径的中间体浓度，适用于低类异戊二烯含量的物种，为研究MEP途径调控和代谢工程改造提供了有力工具。