高级醇 · 代谢工程文献库

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Natural Product Biosynthesis in Escherichia coli: Mentha Monoterpenoids

作者
H.S. Toogood, S. Tait, A. Jervis, A. Ni Cheallaigh, L. Humphreys, E. Takano, J.M. Gardiner, N.S. Scrutton
单位
Manchester Institute of Biotechnology, Faculty of Life Sciences, University of Manchester; Manchester Institute of Biotechnology, SYNBIOCHEM, University of Manchester; School of Chemistry, Manchester Institute of Biotechnology, University of Manchester; GlaxoSmithKline, Medicines Research Centre
杂志
Methods in Enzymology（2016）
DOI
10.1016/bs.mie.2016.02.020
所属领域
代谢工程 / 合成生物学
关键词
In-Fusion克隆单萜合成生物学大肠杆菌生物转化薄荷醇
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解决的核心问题

在大肠杆菌中构建薄荷单萜（如薄荷醇）的生物合成途径，实现天然产物的微生物生产，替代传统植物提取和化学合成。

研究策略

采用合成生物学方法，利用无缝克隆技术（In-Fusion）将薄荷来源的还原酶基因组装成多基因操纵子，在大肠杆菌中异源表达并优化菌株与表达条件，通过全细胞/细胞提取物生物转化合成薄荷醇。

研究路线图

研究问题：在大肠杆菌中构建薄荷单萜生物合成途径
策略：采用合成生物学无性克隆组装多基因操纵子
关键改造1：构建含NtDBR、MMR、MNMR的DMN操纵子
关键改造2：引入AlkL增强疏水底物跨膜转运
关键改造3：双敲除ahr和yqhD基因减少旁路竞争
系统优化：12种菌株筛选+诱导剂浓度优化
结果：成功合成薄荷醇异构体，GC分离7种单萜
结论：合成生物学实现薄荷醇微生物绿色生产
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核心内容

本研究以大肠杆菌为底盘，采用合成生物学方法重构薄荷单萜类化合物的生物合成途径。针对薄荷来源还原酶基因含有长同源重复序列的特点，开发了基于In-Fusion的无缝克隆策略，将双键还原酶基因NtDBR、薄荷酮还原酶基因MMR和新薄荷醇还原酶基因MNMR组装成多基因操纵子，实现了含重复序列多基因的稳定共表达。以pulegone为底物进行全细胞生物转化，成功合成薄荷醇异构体，并通过GC分离检测到7种单萜产物。研究系统考察了12种大肠杆菌菌株和诱导剂浓度对产量的影响，发现菌株背景和表达条件均显著影响薄荷醇的最终产量。此外，异源表达外膜蛋白AlkL可将疏水底物的氧化活性提高28倍，提示跨膜转运对底物供给的重要性。该方法验证了通过无缝克隆和表达优化从廉价底物微生物合成薄荷醇的可行性，为薄荷油等天然产物的绿色生产（全球薄荷油市场年产量约31,000吨、价值约4亿美元）提供了替代植物提取和化学合成的潜在路线。

创新点

开发了针对重复序列的In-Fusion克隆策略，实现含长同源重复序列的多基因共表达构建；系统研究了菌株和诱导条件对薄荷醇产量的影响。

研究对象（5）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Escherichia coli 薄荷醇生物合成途径 NtDBR 双键还原酶（NtDBR） 催化 来自烟草，催化pulegone还原为menthone/isomenthone，构建DMN操纵子时位于pET21b载体上，含C端His标签
Escherichia coli 薄荷醇生物合成途径 MMR 薄荷酮:薄荷醇还原酶（MMR） 催化 来自Mentha piperita，催化menthone还原为menthol，含C端His标签
Escherichia coli 薄荷醇生物合成途径 MNMR 薄荷酮:新薄荷醇还原酶（MNMR） 催化 来自Mentha piperita，催化menthone还原为neomenthol，需N端His标签才能在大肠杆菌中表达
Escherichia coli 疏水底物跨膜转运 alkL 外膜蛋白AlkL 转运 来自Pseudomonas fluorescens CHA0，增强疏水底物跨膜转运，使十二烷酸甲酯氧化活性提高28倍
Escherichia coli 竞争性旁路途径 ahr; yqhD 醛脱氢酶Ahr/YqhD 催化 大肠杆菌内源性酶，与丙烷合成竞争丁醛前体，双敲除可提高产量

关键发现

  1. 以pulegone为底物，通过构建含NtDBR、MMR和MNMR的三基因操纵子（DMN）的大肠杆菌，成功合成了薄荷醇异构体
  2. GC可分离7种单萜。薄荷油市场约31,000吨/年、价值3.73–4.01亿美元
  3. Taxol全合成产率仅0.02%
  4. 异源表达AlkL可使疏水底物氧化活性提高28倍
  5. 用12种大肠杆菌菌株筛选时薄荷醇产量差异显著
  6. 诱导剂浓度对产量有显著影响（如SDS-PAGE/Western blot所示）。

研究结论

合成生物学方法可实现在大肠杆菌中重构薄荷单萜生物合成途径，通过无缝克隆组装、菌株筛选和表达优化，能够从廉价底物生产薄荷醇等化合物，为绿色化学品生产提供可行路线。

源文件 10.1016%bs.mie.2016.02.020.md · 57600 字符 · 抽取模型 deepseek-v4-flash · 21237 token