cis-Prenyltransferase and Polymer Analysis from a Natural Rubber Perspective
- 作者
- M. Kwon, E.-J.G. Kwon, D.K. Ro
- 单位
- 加拿大卡尔加里大学
- 杂志
- Methods in Enzymology（2016）
- DOI
- 10.1016/bs.mie.2016.02.026
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
解决使用rer2酵母突变体进行CPT互补实验时出现回复突变导致结果不可靠的问题，并建立稳定体系以验证真核CPT/CBP异源蛋白复合物的功能。
研究策略
构建rer2Δ srt1Δ双敲除酵母菌株，利用拟南芥AtCPT1和AtLEW1进行体内互补和体外微体酶活分析。
核心内容
本研究针对利用酿酒酵母rer2突变体开展顺式异戊烯转移酶（CPT）互补实验时因回复突变导致结果不可靠的问题，构建了rer2Δ srt1Δ双敲除菌株作为稳定的异源表达宿主。研究发现rer2突变体的回复突变频率高达约1/20,000，严重影响功能验证的准确性。在双敲除菌株中，来自拟南芥的AtCPT1与AtLEW1共表达可完全恢复多萜醇生物合成功能，而二者单独表达均无效，证实了真核CPT/CBP异源复合物的必要性。体外微体酶活测定显示，AtCPT1/AtLEW1复合物的IPP掺入率为12.0±0.3 pmol/μg/h，2小时内约29.9%的IPP被掺入，约为RER2对照（1.9±0.1 pmol/μg/h，掺入率4.8%）的6倍。此外，回复突变株产生的多萜醇链长为19–22个异戊二烯单位，而野生型为14–18个。该双敲除菌株为评估真核CPT与CBP功能提供了可靠工具，并有力支持了真核CPT/CBP异源复合物模型。
创新点
发现rer2突变体回复突变频率高达1/20,000；构建了稳定的rer2Δ srt1Δ双敲除菌株，证明拟南芥AtCPT1/AtLEW1复合物可功能互补该菌株，而单独表达无效。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 多萜醇生物合成 | RER2 | RER2 | 催化 | 酵母顺式异戊烯转移酶，催化多萜醇合成 |
| 酿酒酵母 | 多萜醇生物合成 | SRT1 | SRT1 | 催化 | 酵母第二拷贝顺式异戊烯转移酶，基础水平表达，其激活导致回复突变 |
| 酿酒酵母 | 多萜醇生物合成 | NUS1 | NUS1 | 调控 | 酵母的CBP同源蛋白，与RER2互作形成异源复合物 |
| 酿酒酵母 (重组菌株rer2Δ srt1Δ) | 多萜醇/天然橡胶生物合成 | AtCPT1 | AtCPT1 | 催化 | 拟南芥类II CPT，需与CBP形成复合物发挥活性 |
| 酿酒酵母 (重组菌株rer2Δ srt1Δ) | 多萜醇/天然橡胶生物合成 | AtLEW1 | AtLEW1 | 调控 | 拟南芥CBP（CTP结合蛋白），非催化亚基，与AtCPT1互作 |
关键发现
- 回复突变频率约1/20,000酵母细胞
- rer2Δ srt1Δ双敲除菌株中，AtCPT1与AtLEW1共表达可完全互补，单独AtCPT1或AtLEW1均不能
- 微体酶活测定显示AtCPT1/AtLEW1的IPP掺入率为12.0±0.3 pmol/μg/h，2小时内29.9%的IPP被掺入，而RER2对照为1.9±0.1 pmol/μg/h，掺入率4.8%，前者约为后者的6倍
- 回复突变产生的多萜醇长度为19-22个异戊二烯单位，而野生型为14-18个。
研究结论
rer2Δ srt1Δ双敲除酵母菌株是评估真核顺式异戊烯转移酶（CPT）和CPT结合蛋白（CBP）功能的可靠工具，验证了拟南芥AtCPT1/AtLEW1异源复合物的体内外活性，支持真核CPT/CBP异源复合物模型。