Engineering Microbes to Synthesize Plant Isoprenoids
- 作者
- K. Zhou, S. Edgar, G. Stephanopoulos
- 单位
- National University of Singapore; Massachusetts Institute of Technology
- 杂志
- Methods in Enzymology（2017）
- DOI
- 10.1016/bs.mie.2016.03.007
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何利用微生物高效合成植物来源的异戊二烯类化合物，并解决MEP通路基因表达优化和疏水性产物功能化（如细胞色素P450氧化）的挑战
研究策略
采用模块化基因工程（将MEP基因与异戊二烯合酶分别作为模块，用不同启动子和复制起点调节表达水平），结合生物反应器工艺优化，并利用大肠杆菌-酿酒酵母共培养体系实现异戊二烯骨架的氧化功能化
核心内容
该研究针对微生物合成植物异戊二烯类化合物面临的两大挑战，即MEP通路基因表达水平难以协调以及疏水性产物需经细胞色素P450氧化功能化，提出了一套完整的方法学方案。研究者采用模块化基因工程策略，将MEP通路基因与异戊二烯合酶分别置于不同启动子和复制起点的质粒中，以三个拷贝数梯度（pSC101约5、p15A约10、pBR322约20）调控表达，发现MEP基因需低水平表达而异戊二烯合酶则需强过表达。为加速载体构建，引入CLIVA方法实现快速组装。进一步创新性地构建了大肠杆菌与酿酒酵母共培养体系，以木糖为唯一碳源建立互养关系，大肠杆菌负责提供碳源并去除抑制性乙酸，酵母则表达丹参来源的SmCYP_SmCPR，将C20异戊二烯骨架氧化，培养96小时并每24小时取样监测。该方案涵盖了从基因表达优化、生物反应器放大到共培养功能化的完整技术路径，为微生物合成复杂植物萜类化合物提供了可操作的实验框架。
创新点
提出简化模块化优化流程；利用CLIVA方法快速构建表达载体；首创将代谢通路分布在大肠杆菌和酵母共培养体系中，以木糖为唯一碳源建立互养关系，实现CYP介导的氧化功能化
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli MG1655 (ΔrecA ΔendA DE3 ΔaraA::Ptrc-dxs-idi-ispDF) | MEP pathway | dxs | DXS (1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase) | 催化 | MEP途径第一个限速酶，过表达可增强碳流进入通路 |
| Escherichia coli MG1655 (ΔrecA ΔendA DE3 ΔaraA::Ptrc-dxs-idi-ispDF) | MEP pathway | idi | IDI (isopentenyl diphosphate isomerase) | 催化 | 催化DMAPP异构化为IPP，平衡两种前体比例 |
| Escherichia coli MG1655 (ΔrecA ΔendA DE3 ΔaraA::Ptrc-dxs-idi-ispDF) | MEP pathway | ispDF | IspDF (2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate cytidylyltransferase / 2-C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate synthase) | 催化 | MEP途径下游酶，促进IPP/DMAPP合成 |
| Escherichia coli | C20 isoprenoid biosynthesis | ggpps | GGPP synthase (geranylgeranyl pyrophosphate synthase from Taxus canadensis) | 催化 | 催化FPP与IPP缩合生成GGPP，C20异戊二烯前体 |
| Escherichia coli | C20 isoprenoid biosynthesis | ksl_cps | miltiradiene synthase (fusion enzyme) | 催化 | 催化GGPP环化生成miltiradiene（丹参酮骨架） |
| Saccharomyces cerevisiae | Isoprenoid oxygenation | SmCYP | CYP (cytochrome P450 from Salvia miltiorrhiza) | 催化 | 催化异戊二烯骨架的氧化反应，实现功能化 |
| Saccharomyces cerevisiae | Isoprenoid oxygenation | SmCPR | CPR (NADPH-cytochrome P450 reductase from Salvia miltiorrhiza) | 催化 | 为CYP提供电子，参与电子传递 |
| Escherichia coli + Saccharomyces cerevisiae (coculture) | C20 isoprenoid oxygenation via microbial consortium | — | — | 催化 | E. coli生产异戊二烯骨架，S. cerevisiae表达CYP/CPR进行氧化；以木糖为唯一碳源建立互养关系 |
关键发现
- 论文是方法学章节，未给出最终产量数据，但通过模块化工程发现MEP基因需低水平表达而IsoSs需强过表达（此前研究taxadiene产量达到约1 g/L，但本文未直接报道）
- 构建了三个不同拷贝数质粒（pSC101约5、p15A约10、pBR322约20）表达ksl_cps-ggpps
- 利用CLIVA方法成功组装表达载体
- 共培养体系中酿酒酵母不能利用木糖，依赖大肠杆菌提供碳源，同时去除抑制性乙酸，实现互养共培养
- 酵母中表达SmCYP_SmCPR后，可将C20异戊二烯骨架氧化，培养96小时并每24小时取样检测
- 使用的抗生素浓度分别为50 mg/L壮观霉素、34 mg/L氯霉素、50 mg/L碳青霉素
- DMSO浓度低于1%不影响酵母生长，异戊二烯-DMSO贮备液浓度为5 g/L。
研究结论
本研究提供了从基因表达优化、生物反应器放大到共培养功能化的完整方案，可用于微生物合成植物异戊二烯类化合物，尤其是C20类；通过模块化调节MEP基因和异戊二烯合酶表达水平，结合共培养策略，可有效提高产量并实现复杂氧化反应。