高级醇 · 代谢工程文献库

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In Vivo Platforms for Terpenoid Overproduction and the Generation of Chemical Diversity

作者
Guangkai Bian, Tian Ma, Tiangang Liu
单位
Key Laboratory of Combinatorial Biosynthesis and Drug Discovery, Ministry of Education and School of Pharmaceutical Sciences, Wuhan University, Wuhan, PR China; Hubei Engineering Laboratory for Synthetic Microbiology, Wuhan Institute of Biotechnology, Wuhan, PR China
杂志
Methods in Enzymology（2018）
DOI
10.1016/bs.mie.2018.04.025
所属领域
代谢工程/合成生物学
关键词
MVA pathwayastaxanthinfarnesenegenome miningin vitro reconstitutionlycopenemetabolic engineeringtaxadieneterpene cyclasesterpenoids
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解决的核心问题

萜类化合物天然产量低、成本高，以及新萜类化合物发现效率低的问题

研究策略

通过体外重构MVA途径并进行动力学分析，确定限速步骤和最优酶比例，据此在体内进行靶向代谢工程改造实现高效生产；同时利用高效前体供应平台，结合组合生物合成策略对萜烯环化酶进行基因组挖掘，扩展化学多样性

研究路线图

100%
问题：萜类产量低&新萜发现难
策略：体外重构MVA+动力学分析
体外重构定限速酶与比例
体内靶向改造高效平台
多功能环化酶挖掘+组合生物合成
结果：法尼烯1.1 g/L（2000倍）；番茄红素34.3 mg/g DCW；虾青素8.64 mg/g DCW；紫杉二烯11.3 mg/L；FgMS/FgGS产51种萜；7种新萜（含3种新骨架）
结论：体外指导的靶向工程高效提升产量；组合平台加速新萜发现
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核心内容

该研究开发了一套体外重构指导的靶向代谢工程策略，用于提高大肠杆菌中萜类化合物的产量并扩展其化学多样性。研究者首先在体外重构MVA途径并进行动力学分析，确定Idi是重要限速酶，据此在体内优化各酶表达比例。结果表明，单独提高Idi浓度可使法尼烯初始速率提升17倍，协同上调Idi、ERG13、ERG8和AFS后产量提高5倍，最终在摇瓶中法尼烯产量达1.1 g/L，为初始水平的2000倍；番茄红素在100-L发酵罐中达34.3 mg/g DCW，虾青素达8.64 mg/g DCW且为3S,3'S构型，紫杉二烯产量为11.3 mg/L。此外，利用该高效前体供应平台对多功能萜烯环化酶FgMS和FgGS进行组合生物合成与基因组挖掘，体外直接转化GPP、FPP、GGPP和GFPP产生51种萜类产物，体内获得多种倍半萜、二萜和二倍半萜，其中7种为新萜类化合物、含3种新骨架。该研究证明了体外重构指导策略可高效、准确地提升多种萜类产量，同时大幅加速新型萜类的发现与功能表征。

创新点

建立体外重构指导的靶向代谢工程策略；发现Idi是重要限速酶；基于高效平台充分挖掘多功能萜烯环化酶，获得新骨架萜类

研究对象（23）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
E. coli BL21(DE3) — — — 区室化 用于法尼烯、番茄红素、紫杉二烯及FgMS/FgGS产物生产
E. coli K12 MG1655(DE3) — — — 区室化 用于虾青素生产
E. coli BL21(DE3) MVA pathway atoB AtoB 催化 乙酰辅酶A乙酰转移酶，催化乙酰辅酶A生成乙酰乙酰辅酶A
E. coli BL21(DE3) MVA pathway erg13 ERG13 催化 HMG-CoA合酶
E. coli BL21(DE3) MVA pathway thmg1 tHMG1 催化 截短的HMG-CoA还原酶，来自酵母
E. coli BL21(DE3) MVA pathway erg12 ERG12 催化 甲羟戊酸激酶
E. coli BL21(DE3) MVA pathway erg8 ERG8 催化 磷酸甲羟戊酸激酶
E. coli BL21(DE3) MVA pathway mvd1 MVD1 催化 甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶
E. coli BL21(DE3) MVA pathway idi Idi 催化 IPP异构酶，体外重构显示增加其浓度可17倍提高法尼烯初始速率，是重要限速步骤
E. coli BL21(DE3) MVA pathway ispA IspA 催化 法尼基焦磷酸合酶（FPP合酶）
E. coli BL21(DE3) 倍半萜合成 afs AFS 催化 α-法尼烯合酶，来自苹果
E. coli BL21(DE3) 类胡萝卜素合成 crtE CrtE 催化 GGPP合酶，来自Pantoea ananatis
E. coli BL21(DE3) 类胡萝卜素合成 crtB CrtB 催化 八氢番茄红素合酶
E. coli BL21(DE3) 类胡萝卜素合成 crtI CrtI 催化 八氢番茄红素脱氢酶
E. coli BL21(DE3) 虾青素合成 crtY CrtY 催化 番茄红素环化酶，来自Pantoea agglomerans
E. coli BL21(DE3) 虾青素合成 crtZ CrtZ 催化 β-胡萝卜素羟化酶
E. coli BL21(DE3) 虾青素合成 crtW CrtW 催化 β-胡萝卜素酮醇酶，来自Brevundimonas sp. SD212
E. coli BL21(DE3) 紫杉二烯合成 ts TS 催化 紫杉二烯合酶
E. coli BL21(DE3) 紫杉二烯合成 gpps GGPPS 催化 香叶基香叶基焦磷酸合酶
E. coli BL21(DE3) 萜类前体合成 FPPS FPPS 催化 法尼基焦磷酸合酶（与IspA类似，用于组合生物合成）
E. coli BL21(DE3) 萜类前体合成 GFPPs GFPPs 催化 香叶基法尼基焦磷酸合酶，用于生成C25前体
E. coli BL21(DE3) 萜烯环化 FgMS FgMS 催化 来自Fusarium graminearum的嵌合萜烯环化酶，含prenyltransferase和cyclase域，可利用IPP/DMAPP或直接利用GPP/FPP/GGPP/GFPP生成多种萜类
E. coli BL21(DE3) 萜烯环化 FgGS FgGS 催化 来自Fusarium graminearum的I类萜烯合酶，底物宽泛，可产生倍半萜、二萜及二倍半萜

关键发现

  1. 体外重构动力学分析表明，单独提高Idi浓度可17倍增加法尼烯初始速率，协同提高Idi、ERG13、ERG8和AFS可使产量提高5倍
  2. 按AtoB:ERG13:tHMG1:ERG12:ERG8:MVD1:Idi:IspA:AFS=1:10:2:5:5:2:5:2:2调整后，法尼烯产量达1.1 g/L（摇瓶，为初始的2000倍）。番茄红素在100-L发酵罐中产量达34.3 mg/g DCW（1.23 g/L）。虾青素产量达8.64 mg/g DCW，且为3S,3'S构型。紫杉二烯摇瓶产量为11.3 mg/L。FgMS和FgGS体外可直接转化GPP/FPP/GGPP/GFPP产生51种萜类产物
  3. 体内组合生物合成获得1种倍半萜、11种二萜和8种二倍半萜，其中7种新萜类（含3种新骨架）被结构鉴定。

研究结论

体外重构指导的靶向代谢工程策略能高效、准确地提高多种萜类化合物的产量；基于该平台结合组合生物合成和基因组挖掘，可显著加速萜烯环化酶功能表征与新型萜类发现，扩展萜类化学多样性。