Screening and characterization of proteorhodopsin color-tuning mutations in Escherichia coli with endogenous retinal synthesis
- 作者
- So Young Kim, Stephen A. Waschuk, Leonid S. Brown, Kwang-Hwan Jung
- 单位
- Department of Life Science and Interdisciplinary Program of Integrated Biotechnology, Sogang University; Department of Physics, University of Guelph
- 杂志
- Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics（2008）
- DOI
- 10.1016/j.bbabio.2008.03.010
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
鉴定影响蛋白视紫红质光谱调谐的关键氨基酸残基，并解析其突变对光谱特性和质子泵功能的影响。
研究策略
利用随机PCR诱变构建突变体库，通过大肠杆菌内源视黄醛合成系统进行颜色表型筛选；对多突变体采用定点突变分离单突变；通过吸收光谱、pH滴定、闪光光解及质子泵活性测定系统表征突变体。
核心内容
该研究通过随机PCR诱变构建了蒙特利湾蛋白视紫红质（GPR）的突变体库，并利用大肠杆菌内源视黄醛合成系统建立了无需外源添加视黄醛的颜色筛选平台，以鉴定影响光谱调谐的关键氨基酸残基。从775个菌落中筛得53个颜色改变菌落，最终获得16个分离株并解析出20个影响光谱特性的单突变，其中8个红移、12个蓝移。突变体吸收峰范围覆盖493 nm至568 nm，相较野生型在酸性和碱性条件下的548 nm和520 nm有明显偏移。所有突变体的pKa值介于6.3至8.4之间，与野生型的7.3形成对比。光循环动力学分析显示，多数低泵活性突变体的M态和O态衰变显著减慢，例如T101A的M态衰变为164 ms、Y200N的O态衰变为2230 ms，而野生型分别为10 ms和48 ms；T101A/I194N双突变体的质子泵活性仅为野生型的约30%。这些结果表明颜色调谐残基广泛分布于蛋白整体而不限于视黄醛结合口袋，且光谱调谐通常伴随光循环速率和质子泵活性的改变，提示颜色适应与蛋白质功能存在紧密关联。
创新点
建立无需外源视黄醛的大肠杆菌颜色筛选系统；发现颜色调谐残基广泛分布于蛋白整体，不限于视黄醛结合口袋；发现约一半突变位于螺旋C和D；建立光谱调谐与光循环/质子泵活性的关联。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli β/UT | β-胡萝卜素转化为视黄醛 | β-diox | 15,15'-β-胡萝卜素双加氧酶 | 催化 | 小鼠来源，催化β-胡萝卜素中央裂解产生全反式视黄醛 |
| Escherichia coli (UT5600/β/UT) | 光驱动质子泵 | MBP (Monterey Bay proteorhodopsin gene) | Proteorhodopsin (GPR) | 转运 | 野生型及20个颜色调谐单突变体（如T101A、C107R、Y200H等） |
关键发现
- 从775个菌落中筛得53个颜色改变菌落（6.8%），最终获16个分离株，分离出20个影响光谱特性的单突变
- 其中8个突变体吸收峰红移、12个蓝移。野生型PR在酸性（pH4.0）和碱性（pH10.0）下吸收峰分别为548 nm和520 nm
- 突变体吸收峰范围从493 nm（W98G碱性）到568 nm（T101A/I194N酸性）。突变体pKa值介于6.3-8.4之间（野生型7.3）。光循环动力学显示，多数低泵活性突变体具有较慢的M和O衰变（如T101A M decay 164 ms、Y200N O decay 2230 ms，而野生型M decay 10 ms、O decay 48 ms）。质子泵活性相对野生型降低，T101A/I194N约为野生型的30%。
研究结论
颜色调谐残基不限于视黄醛结合口袋，该结果支持近期进化分析；光谱调谐突变通常影响光循环速率和质子泵活性，提示颜色调谐与生物适应性密切相关。