Molecular cloning and functional characterization of three terpene synthases from unripe fruit of black pepper (Piper nigrum)
- 作者
- Zhehao Jin, Moonhyuk Kwon, Ah-Reum Lee, Dae-Kyun Ro, Juraithip Wungsintaweekul, Soo-Un Kim
- 单位
- 首尔国立大学农业生物技术系及农业科学研究所; 卡尔加里大学生物科学系; 宋卡王子大学药学科学学院生药学与药用植物学系; 长江大学园艺与园林学院
- 杂志
- Archives of Biochemistry and Biophysics（2018）
- DOI
- 10.1016/j.abb.2017.12.011
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
鉴定黑胡椒未成熟果实中负责风味相关倍半萜生物合成的萜烯合酶基因
研究策略
利用Illumina转录组测序，以amorpha-4,11-diene synthase为查询序列挖掘候选倍半萜合酶基因，克隆三个全长cDNA，并在大肠杆菌和工程酵母中异源表达，通过体外酶活测定与体内产物分析进行功能鉴定，结合系统发育和QRT-PCR分析组织表达模式
研究路线图
核心内容
本研究利用Illumina转录组测序从黑胡椒未成熟果实中挖掘倍半萜合酶候选基因，以amorpha-4,11-diene synthase为查询序列，成功克隆了三个全长cDNA，分别编码石竹烯合酶（PnCPS）、杜松醇/杜松烯合酶（PnCO/CDS）和大牻牛儿烯D合酶（PnGDS），并在大肠杆菌和工程酵母中异源表达。体外酶活测定显示，PnCPS主产β-石竹烯（占97%），PnCO/CDS主产δ-杜松醇（占91%），PnGDS主产大牻牛儿烯D（占91%）；动力学参数显示三者kcat/Km介于20.2至37.7 s⁻¹ mM⁻¹之间。值得注意的是，PnGDS在酵母发酵中因酸性条件发生重排，产物变为copaene（59%）和β-cadinene（38%），提示异源体内产物可能不代表真实酶促产物。表达分析表明，未成熟果实中β-石竹烯占总倍半萜的65.8%，PnCPS转录本丰度最高，与产物积累一致。该研究首次从黑胡椒中功能鉴定了三个萜烯合酶，揭示了风味倍半萜的生物合成基础，并为酸性条件下的产物鉴定提供了警示。
创新点
首次从黑胡椒未成熟果实中克隆并功能鉴定了三个倍半萜合酶（石竹烯合酶、杜松醇/杜松烯合酶、大牻牛儿烯D合酶）；通过体内外实验揭示了大牻牛儿烯D在酸性条件下的重排现象，警示异源体内产物可能不代表真实酶促产物
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli Rosetta 2(DE3) | 倍半萜生物合成 | PnTPS1（PnCPS） | 石竹烯合酶 | 催化 | 体外重组表达，主产物β-石竹烯，副产物蛇麻烯；基因登录号KU953957 |
| 酿酒酵母EPY300 | 倍半萜生物合成 | PnTPS1（PnCPS） | 石竹烯合酶 | 催化 | 体内表达产生石竹烯97%和蛇麻烯3% |
| Escherichia coli Rosetta 2(DE3) | 倍半萜生物合成 | PnTPS2（PnCO/CDS） | 杜松醇/杜松烯合酶 | 催化 | 体外产物δ-cadinol 91%，α-cadinene 12%和δ-cadinene 10%（体外法）；基因登录号KU953958 |
| 酿酒酵母EPY300 | 倍半萜生物合成 | PnTPS2（PnCO/CDS） | 杜松醇/杜松烯合酶 | 催化 | 体内产物δ-cadinol 91%，α-cadinene 2%，δ-cadinene 7% |
| Escherichia coli Rosetta 2(DE3) | 倍半萜生物合成 | PnTPS3（PnGDS） | 大牻牛儿烯D合酶 | 催化 | 体外主要产物germacrene D 91%，copaene 6%，cubebene 3%；基因登录号MF104556 |
| 酿酒酵母EPY300 | 倍半萜生物合成 | PnTPS3（PnGDS） | 大牻牛儿烯D合酶 | 催化 | 体内因酸性重排产生copaene 59%和β-cadinene 38% |
关键发现
- 转录组获得49,413,668条clean reads，组装出66,787个unigenes，其中三个全长TPS。PnTPS1（石竹烯合酶）体外主产物β-caryophyllene占97%，humulene占3%
- PnTPS2（杜松醇/杜松烯合酶）主产物δ-cadinol占91%，α-cadinene占2%，δ-cadinene占7%
- PnTPS3（大牻牛儿烯D合酶）体外产物germacrene D占91%，copaene占6%，cubebene占3%，但在酵母发酵中因酸性重排产生copaene 59%和β-cadinene 38%。动力学参数：Km分别为21.06±4.71、18.40±4.94、9.152±1.813 μM，kcat分别为0.455±0.003、0.694±0.066、0.185±0.012 s^-1，kcat/Km分别为0.0216、0.0377、0.0202 s^-1 μM^-1（即20.2-37.7 s^-1 mM^-1）。未成熟果实中β-caryophyllene占总倍半萜的65.8%，copaene占8.3%
- PnCPS转录本在果实中最高，与β-caryophyllene优势积累一致。叶子中PnGDS转录本比PnCPS和PnCO/CDS高9倍。
研究结论
三个倍半萜合酶PnCPS、PnCO/CDS和PnGDS负责黑胡椒中主要风味倍半萜的合成，其中β-石竹烯是最主要的倍半萜；PnGDS的产物germacrene D在酸性条件下易重排为copaene和cadinene类化合物；未检测到rotundone前体α-guaiene合酶基因，其可能在特定品种或发育阶段表达。