Expression in and purification of Hepatitis B surface antigen (S-protein) from methyotrophic yeast Pichia pastoris
- 作者
- Nirmala Bardiya
- 单位
- Center for Advanced Bioseparation Technology Laboratory, Inha University, 253 Yong Hyun Dong, Nam Ku, Inchon- 402751, Republic of South Korea
- 杂志
- Anaerobe（2006）
- DOI
- 10.1016/j.anaerobe.2006.05.002
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
在毕赤酵母中高效表达并纯化重组乙肝表面抗原（rHBsAg），解决纯化困难、抗原性损失等问题。
研究策略
利用甲醇营养型毕赤酵母GS115的MutS菌株，在AOX1启动子控制下胞内表达rHBsAg，然后通过细胞破碎、气溶胶吸附/解吸、阴离子交换和凝胶过滤两步色谱进行纯化，并考察去污剂、压力等条件对得率和抗原性的影响。
核心内容
本研究在甲醇营养型毕赤酵母GS115的MutS菌株中，利用AOX1启动子控制下实现了重组乙肝表面抗原（rHBsAg）的胞内表达，并系统评估了细胞破碎压力、去污剂及储存条件对产物得率和抗原性的影响。经72小时甲醇诱导，rHBsAg浓度达12.5 μg/mL，总蛋白约2.4 g/L。纯化采用气溶胶吸附-解吸结合阴离子交换与凝胶过滤两步色谱法，避免了单克隆抗体依赖。结果显示，破碎压力12Kpsi×3次与30Kpsi×1次均有效，PBS中总蛋白回收率分别为76.52%和93.91%；吸附步骤在PBS中非结合蛋白仅150-170 mg/L，显著优于PBST。纯化后蛋白浓度分别为725 mg/L和27 mg/L。研究还发现Triton X100和脱氧胆酸盐会降低储存稳定性，而增加甲醇诱导次数可提高表达量。该策略提供了一条无需抗体、操作简便的rHBsAg纯化路线，且气溶胶吸附可有效浓缩目标蛋白，为疫苗抗原生产提供了可行参考。
创新点
系统评估了细胞破碎压力、去污剂、解吸条件及储存温度对rHBsAg抗原性和得率的影响；采用aerosil吸附-解吸结合两步色谱法纯化，避免了使用单克隆抗体的传统方法。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris GS115 | 甲醇利用通路 | AOX1 | 酒精氧化酶（AOX1） | 催化 | 其启动子驱动rHBsAg表达，MutS表型因AOX1被破坏而生长缓慢。 |
| Pichia pastoris GS115 | HBsAg表达 | HBsAg编码基因（S基因） | 重组HBsAg（rHBsAg） | 区室化 | 226个氨基酸，可自组装成病毒样颗粒，目标蛋白。 |
关键发现
- 在MutS菌株中，72h甲醇诱导后rHBsAg浓度达12.5 μg/mL
- 总蛋白约2.4±0.4 g/L细胞裂解液。采用12Kpsi×3次或30Kpsi×1次破碎均有效，PBS中总蛋白回收率分别为PBST的76.52%（1.76 g/L）和93.91%（2.16 g/L）。吸附步骤在PBS中非结合蛋白仅150-170 mg/L，优于PBST的400-660 mg/L。解吸后总蛋白620-750 mg/L。经阴离子交换和凝胶过滤后，蛋白浓度分别为725 mg/L和27 mg/L。Triton X100和脱氧胆酸盐会降低储存稳定性。
研究结论
通过增加甲醇诱导次数可提高rHBsAg表达量；去污剂对储存抗原性有不良影响；aerosol吸附-解吸可浓缩rHBsAg；建议GPC后用胰蛋白酶处理和第二次GPC以获得均一产物。